米非司酮抑制卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性產(chǎn)生的研究

史 欣 葉連紅 李東紅

本試驗(yàn)?zāi)M卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的過程，以米非司酮作為逆轉(zhuǎn)劑，在化療的同時(shí)同步使用，探討在沖擊法的紫杉醇誘導(dǎo)下，米非司酮能否抑制或減慢卵巢癌耐藥性的表達(dá)，并探討其作用機(jī)制、機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、skov3:A2780購買于北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司(細(xì)胞由上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所保存);skov3購買于青島醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研中心，分別置于37℃、相對(duì)濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，于含有10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 試劑和藥品

RPMI-1640及 DMEM購于 Gibco公司，紫杉醇Taxol(6 mg/ml)購自美國百時(shí)美施貴寶公司，米非司酮系浙江仙琚制藥股份公司生產(chǎn)，羅丹明(Rh123)購買于Sigma公司，鼠抗人MDR1單克隆抗體系購買于Boster公司，SP免疫組化試劑盒系購于北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

紫杉醇誘導(dǎo)A2780:取對(duì)數(shù)生長期的A2780，置于含有紫杉醇 (Taxol 0.2 μmol/ml)及10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中1 h后，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，換不含有Taxol 10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至細(xì)胞恢復(fù)對(duì)數(shù)生長，作為陽性對(duì)照;實(shí)驗(yàn)組置于含有0.2 μmol/ml紫杉醇10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中，然后加入 1 μm 、2.5 μm、10 μm 米非司酮(RU486)作用1 h，各組均進(jìn)行30次誘導(dǎo);A2780直接傳代，以不加用紫杉醇誘導(dǎo)耐藥的作為陰性對(duì)照。

紫杉醇誘導(dǎo)skov3:同樣取對(duì)數(shù)生長期的skov3細(xì)胞，應(yīng)用含有1.5 μmol/ml紫杉醇 (Taxol)10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液作用1 h，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，然后換用不含有Taxol的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，至細(xì)胞恢復(fù)對(duì)數(shù)生長，作為陽性對(duì)照;實(shí)驗(yàn)組分別置于1.5 μmol/ml紫杉醇的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，然后加入 1 μM、2.5 μM、10 μM 的米非司酮 (RU486)，同樣作用1 h，各組均進(jìn)行30次誘導(dǎo);同時(shí)以skov3直接傳代后不加紫杉醇的作為陰性對(duì)照。

細(xì)胞形態(tài)觀察及繪制生長曲線:取對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞取5 000個(gè)/孔，放置于37℃、相對(duì)濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁生長后，每天取其中3孔細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察8天，從而繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞半數(shù)致死濃度即IC50值。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞P-gp外排功能。

SP染色:應(yīng)用3%H2O2孵育已制好的細(xì)胞爬片10 min，封閉后依次滴加鼠抗人MDR1單克隆抗體(1∶50)，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，最后觀察P-gp表達(dá)情況。

Western Blotting法:取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，檢測(cè)P-gp濃度后，以1∶4的比例加上樣緩沖液，沸水水浴5 min。采用SDS-多聚丙烯酰胺凝膠電泳法，PVC膜轉(zhuǎn)膜，以鼠抗人MDR1單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜，PBST 3次洗膜后加入二抗孵育2 h。重復(fù)上述PBST洗膜方法于暗室發(fā)光顯帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察

A2780細(xì)胞誘導(dǎo)前細(xì)胞生長良好，形態(tài)規(guī)則，透亮度好，貼壁生長后伸展成梭形。紫杉醇藥物誘導(dǎo)后，細(xì)胞變小，貼壁后細(xì)胞兩尖端變長，細(xì)胞有呈團(tuán)簇狀生長的趨勢(shì)。加用米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述特點(diǎn)，作用過程中米非司酮濃度高組細(xì)胞壞死情況越明顯，其恢復(fù)對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間越長。skov3傳代及其實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)耐藥的各組細(xì)胞均為貼壁生長，于光鏡下觀察，skov3邊界清晰，細(xì)胞呈梭狀，上皮樣生長，細(xì)胞折光性好。經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)后，大部分細(xì)胞發(fā)生壞死及凋亡，存活細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變長、形態(tài)不規(guī)則，大小不一，邊界模糊。誘導(dǎo)過程中形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈不規(guī)則狀，突起增多，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞間隙較大。細(xì)胞畸形核多見，多伸出許多偽足，細(xì)胞質(zhì)顆粒明顯增多。胞質(zhì)內(nèi)則常有顆粒狀囊泡，突起增多。至恢復(fù)對(duì)數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)又慢慢恢復(fù)。加米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述特點(diǎn)，作用過程中米非司酮濃度高組細(xì)胞壞死情況越明顯，其恢復(fù)對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間越長。

2.2 各組生長曲線

圖1 紫杉醇作用A2780后各組生長曲線

圖2 紫杉醇作用skov3后各組生長曲線

由圖1、圖2可見，紫杉醇誘導(dǎo)體外卵巢癌細(xì)胞系(A2780、skov3)，可以使細(xì)胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對(duì)不旺盛的亞群。加入米非司酮可以使這種篩選的傾向性更加明顯，米非司酮的濃度越高，篩選出的亞克隆生長越不活躍。

2.3 各組細(xì)胞紫杉醇24 h的半數(shù)致死濃度(IC50值)

A2780原代細(xì)胞 IC50:(0.061 ±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.082 ±0.003)μmol/ml;紫杉醇 +2.5 μM RU486 組 IC50:(0.096 ±0.004) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組 IC50:(0.110 ±0.003) μmol/ml;紫杉醇組 IC50:(0.127 ±0.008) μmol/ml。因此，應(yīng)用 0.2 μmol/ml紫杉醇誘導(dǎo)30次后:各組A2780細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。使用米非司酮的各組與不使用的陽性對(duì)照組對(duì)紫杉醇耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。不同濃度米非司酮實(shí)驗(yàn)組間對(duì)紫杉醇的耐藥性存在差異，而且呈一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對(duì)地保持對(duì)紫杉醇的敏感性。

skov3原代細(xì)胞 IC50:(0.020±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.151 ± 0.011)μmol/ml;紫杉醇+2.5μM RU486 組 IC50:(0.237 ±0.027) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組IC50:(0.442 ±0.018) μmol/ml，紫杉醇組 IC50:(0.512±0.023) μmol/ml。因此，使用紫杉醇(Taxol)1.5 μmol/ml誘導(dǎo)skov3 30次后:各組skov3細(xì)胞對(duì)于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代skov3細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。米非司酮各組與不使用的陽性對(duì)照組對(duì)紫杉醇的耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。3組使用不同濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組間對(duì)紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組其耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對(duì)地保持對(duì)紫杉醇的敏感性(P＜0.05)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度

A2780組中A2780原代細(xì)胞熒光強(qiáng)度為(98.1±1.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(82.4 ±2.1);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(72.7 ±3.2);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(54.2 ±2.9);單用紫杉醇組為(46.6±2.1)。skov3組中skov3原代細(xì)胞熒光強(qiáng)度為(93.6±2.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(78.8 ±1.8);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(63.3 ±4.5);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(34.7 ±3.9)，單用紫杉醇組為(18.2±2.7)。因此，加入不同濃度米非司酮的誘導(dǎo)耐藥組與單純使用紫杉醇組熒光強(qiáng)度比較有顯著性差異(P＜0.05)。由此表明，不同濃度的米非司酮可以不同程度地增加羅丹明在A2780、skov3兩組細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

2.5 免疫組化SP染色結(jié)果

P-gp在A2780、skov3原代細(xì)胞中均無表達(dá);而在使用不同濃度米非司酮的各組細(xì)胞中均呈陽性表達(dá);在單用紫杉醇誘導(dǎo)的A2780、skov3細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。

2.6 Western Blotting法檢測(cè)P-gp蛋白定量

經(jīng)過紫杉醇的誘導(dǎo)后，加入不同劑量的米非司酮組均呈現(xiàn)P-gp表達(dá)，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達(dá)量與誘導(dǎo)同時(shí)加入米非司酮的濃度呈負(fù)相關(guān)，即米非司酮濃度越高則產(chǎn)生的P-gp量越少，見圖3、圖4，結(jié)果說明誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的同時(shí)加入米非司酮可減慢卵巢癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。

圖3 應(yīng)用紫杉醇后A2780各組P-gp含量

圖4 應(yīng)用紫杉醇后skov3各組P-gp含量

3 討論

卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后化療是目前治療卵巢癌的主要方法，由于卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)不易徹底切除的特點(diǎn)，化療在卵巢癌治療中起了極為重要的作用［1］。但隨著化療療程的增加，大部分化療患者出現(xiàn)了耐藥性，導(dǎo)致化療失敗，5年生存率無明顯改善，這些年來，MDR基因及其表達(dá)物P糖蛋白介導(dǎo)的多重耐藥是腫瘤細(xì)胞耐藥研究的熱點(diǎn)，MDR基因的表達(dá)與多種癌癥細(xì)胞化療耐藥相關(guān)［2］。P糖蛋白介導(dǎo)的多重耐藥是各類腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的經(jīng)典途徑，是目前研究相對(duì)較為深入，同時(shí)機(jī)理較為清晰的途徑。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞的多重耐藥的產(chǎn)生與MDR1基因擴(kuò)增，進(jìn)而使的MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄增加、P-gP產(chǎn)生及增多有關(guān)［3-4］;同時(shí)，另一些耐藥腫瘤細(xì)胞雖無MDR1基因擴(kuò)增，但卻有mRNA轉(zhuǎn)錄增加，最終使的P-gP表達(dá)增加［5］，抑制 MDR 的表達(dá)可以抑制耐藥性的產(chǎn)生［6］。同時(shí)，近年發(fā)現(xiàn)米非司酮等藥物對(duì)婦科惡性腫瘤的治療具有一定的潛力，作為逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物［7］，至今尚未成功用于臨床。因此，探討對(duì)卵巢癌常用藥物紫杉醇的耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)理就成了提高患者生存期的關(guān)鍵。米非司酮對(duì)耐藥的卵巢癌細(xì)胞有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，本實(shí)驗(yàn)旨在研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780、skov3的耐藥性產(chǎn)生過程中所起的作用，是否有降低其耐藥性產(chǎn)生速度的可能。

實(shí)驗(yàn)通過在紫杉醇誘導(dǎo)A2780、skov3產(chǎn)生耐藥過程同時(shí)使用不同濃度的米非司酮產(chǎn)生出各不同濃度的米非司酮與紫杉醇誘導(dǎo)后的A2780、skov3細(xì)胞亞株，觀察各細(xì)胞亞株P(guān)糖蛋白(P-gp)表達(dá)情況及各細(xì)胞亞株的P-gp的含量、檢測(cè)其生長曲線、IC50;以羅丹明123(Rh123)作為熒光探針觀察各細(xì)胞亞株胞內(nèi)羅丹明含量來研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株A2780、skov3的耐藥性的產(chǎn)生。結(jié)果顯示:①A2780、skov3細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞較誘導(dǎo)前變小，細(xì)胞有呈團(tuán)簇狀生長的趨勢(shì)。加用米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述變化的特點(diǎn)，但加入米非司酮濃度大者細(xì)胞壞死出現(xiàn)的越明顯，其恢復(fù)對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間越長。②兩組生長曲線檢測(cè):使用紫杉醇沖擊法誘導(dǎo)體外卵巢癌細(xì)胞系(A2780、skov3)可以使細(xì)胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對(duì)不旺盛的亞群。加入米非司酮的濃度越大，篩選出的亞克隆生長越不活躍。③通過對(duì)半數(shù)致死濃度(IC50值)的測(cè)定，使用紫杉醇作為誘導(dǎo)劑后:首先各組細(xì)胞對(duì)于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780、skov3細(xì)胞對(duì)于紫杉醇的耐藥性有顯著性差異。其次，使用米非司酮的各組與不使用的陽性對(duì)照組對(duì)于紫杉醇的耐藥性也有顯著性差異。最后3組實(shí)驗(yàn)組對(duì)紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定的量效關(guān)系，使用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組耐藥性產(chǎn)生的較慢即能相對(duì)的保持對(duì)紫杉醇的敏感性。A2780、skov3兩組細(xì)胞表現(xiàn)出類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明化療同時(shí)使用非司酮能保持對(duì)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。④應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp功能，羅丹明熒光強(qiáng)度說明在加入了不同濃度米非司酮后，在模擬臨床化療，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的過程中，米非司酮可以增加羅丹明在A2780、skov3兩組細(xì)胞內(nèi)的蓄積，并與其用量相關(guān)。這使得我們從功能上了解了米非司酮抑制耐藥性的可能機(jī)理應(yīng)該與減低細(xì)胞非特異性外排的機(jī)能高度相關(guān)。⑤免疫組化及Western Blotting結(jié)果顯示，使用紫杉醇誘導(dǎo)A2780組呈現(xiàn)出與紫杉醇誘導(dǎo)skov3組相似的結(jié)果，經(jīng)過紫杉醇的誘導(dǎo)后，加入不同劑量的米非司酮均有P-gp表達(dá)出現(xiàn)，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達(dá)量與誘導(dǎo)同時(shí)加入米非司酮的量呈負(fù)相關(guān)，即加入劑量越大的米非司酮?jiǎng)t產(chǎn)生的P-gp越少，這從機(jī)理上驗(yàn)證了由前面MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的、在誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的同時(shí)加入米非司酮，減慢了卵巢癌細(xì)胞的耐藥性的產(chǎn)生。

米非司酮對(duì)人耐藥卵巢癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。米非司酮抑制耐藥性表現(xiàn)應(yīng)該與減低細(xì)胞非特異性外排的機(jī)能有關(guān)，其對(duì)卵巢癌的治療具有進(jìn)一步的臨床研究價(jià)值。

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