米非司酮抑制卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性產(chǎn)生的研究

史 欣 葉連紅 李東紅

本試驗(yàn)?zāi)M卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的過程，以米非司酮作為逆轉(zhuǎn)劑，在化療的同時(shí)同步使用，探討在沖擊法的紫杉醇誘導(dǎo)下，米非司酮能否抑制或減慢卵巢癌耐藥性的表達(dá)，并探討其作用機(jī)制、機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、skov3:A2780購買于北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司(細(xì)胞由上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所保存);skov3購買于青島醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研中心，分別置于37℃、相對濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，于含有10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 試劑和藥品

RPMI-1640及 DMEM購于 Gibco公司，紫杉醇Taxol(6 mg/ml)購自美國百時(shí)美施貴寶公司，米非司酮系浙江仙琚制藥股份公司生產(chǎn)，羅丹明(Rh123)購買于Sigma公司，鼠抗人MDR1單克隆抗體系購買于Boster公司，SP免疫組化試劑盒系購于北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

紫杉醇誘導(dǎo)A2780:取對數(shù)生長期的A2780，置于含有紫杉醇 (Taxol 0.2 μmol/ml)及10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中1 h后，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，換不含有Taxol 10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至細(xì)胞恢復(fù)對數(shù)生長，作為陽性對照;實(shí)驗(yàn)組置于含有0.2 μmol/ml紫杉醇10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中，然后加入 1 μm 、2.5 μm、10 μm 米非司酮(RU486)作用1 h，各組均進(jìn)行30次誘導(dǎo);A2780直接傳代，以不加用紫杉醇誘導(dǎo)耐藥的作為陰性對照。

紫杉醇誘導(dǎo)skov3:同樣取對數(shù)生長期的skov3細(xì)胞，應(yīng)用含有1.5 μmol/ml紫杉醇 (Taxol)10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液作用1 h，用磷酸鹽緩沖液洗3遍，然后換用不含有Taxol的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，至細(xì)胞恢復(fù)對數(shù)生長，作為陽性對照;實(shí)驗(yàn)組分別置于1.5 μmol/ml紫杉醇的10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，然后加入 1 μM、2.5 μM、10 μM 的米非司酮 (RU486)，同樣作用1 h，各組均進(jìn)行30次誘導(dǎo);同時(shí)以skov3直接傳代后不加紫杉醇的作為陰性對照。

細(xì)胞形態(tài)觀察及繪制生長曲線:取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞取5 000個(gè)/孔，放置于37℃、相對濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁生長后，每天取其中3孔細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察8天，從而繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測各組細(xì)胞半數(shù)致死濃度即IC50值。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞P-gp外排功能。

SP染色:應(yīng)用3%H2O2孵育已制好的細(xì)胞爬片10 min，封閉后依次滴加鼠抗人MDR1單克隆抗體(1∶50)，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，最后觀察P-gp表達(dá)情況。

Western Blotting法:取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，檢測P-gp濃度后，以1∶4的比例加上樣緩沖液，沸水水浴5 min。采用SDS-多聚丙烯酰胺凝膠電泳法，PVC膜轉(zhuǎn)膜，以鼠抗人MDR1單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜，PBST 3次洗膜后加入二抗孵育2 h。重復(fù)上述PBST洗膜方法于暗室發(fā)光顯帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察

A2780細(xì)胞誘導(dǎo)前細(xì)胞生長良好，形態(tài)規(guī)則，透亮度好，貼壁生長后伸展成梭形。紫杉醇藥物誘導(dǎo)后，細(xì)胞變小，貼壁后細(xì)胞兩尖端變長，細(xì)胞有呈團(tuán)簇狀生長的趨勢。加用米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述特點(diǎn)，作用過程中米非司酮濃度高組細(xì)胞壞死情況越明顯，其恢復(fù)對數(shù)生長期的時(shí)間越長。skov3傳代及其實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)耐藥的各組細(xì)胞均為貼壁生長，于光鏡下觀察，skov3邊界清晰，細(xì)胞呈梭狀，上皮樣生長，細(xì)胞折光性好。經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)后，大部分細(xì)胞發(fā)生壞死及凋亡，存活細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變長、形態(tài)不規(guī)則，大小不一，邊界模糊。誘導(dǎo)過程中形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈不規(guī)則狀，突起增多，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞間隙較大。細(xì)胞畸形核多見，多伸出許多偽足，細(xì)胞質(zhì)顆粒明顯增多。胞質(zhì)內(nèi)則常有顆粒狀囊泡，突起增多。至恢復(fù)對數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)又慢慢恢復(fù)。加米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述特點(diǎn)，作用過程中米非司酮濃度高組細(xì)胞壞死情況越明顯，其恢復(fù)對數(shù)生長期的時(shí)間越長。

2.2 各組生長曲線

圖1 紫杉醇作用A2780后各組生長曲線

圖2 紫杉醇作用skov3后各組生長曲線

由圖1、圖2可見，紫杉醇誘導(dǎo)體外卵巢癌細(xì)胞系(A2780、skov3)，可以使細(xì)胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對不旺盛的亞群。加入米非司酮可以使這種篩選的傾向性更加明顯，米非司酮的濃度越高，篩選出的亞克隆生長越不活躍。

2.3 各組細(xì)胞紫杉醇24 h的半數(shù)致死濃度(IC50值)

A2780原代細(xì)胞 IC50:(0.061 ±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.082 ±0.003)μmol/ml;紫杉醇 +2.5 μM RU486 組 IC50:(0.096 ±0.004) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組 IC50:(0.110 ±0.003) μmol/ml;紫杉醇組 IC50:(0.127 ±0.008) μmol/ml。因此，應(yīng)用 0.2 μmol/ml紫杉醇誘導(dǎo)30次后:各組A2780細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。使用米非司酮的各組與不使用的陽性對照組對紫杉醇耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。不同濃度米非司酮實(shí)驗(yàn)組間對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且呈一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對地保持對紫杉醇的敏感性。

skov3原代細(xì)胞 IC50:(0.020±0.002) μmol/ml;紫杉醇 +10 μM RU486 組 IC50:(0.151 ± 0.011)μmol/ml;紫杉醇+2.5μM RU486 組 IC50:(0.237 ±0.027) μmol/ml;紫杉醇 +1 μM RU486 組IC50:(0.442 ±0.018) μmol/ml，紫杉醇組 IC50:(0.512±0.023) μmol/ml。因此，使用紫杉醇(Taxol)1.5 μmol/ml誘導(dǎo)skov3 30次后:各組skov3細(xì)胞對于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代skov3細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性比較有顯著性差異(P＜0.05)。米非司酮各組與不使用的陽性對照組對紫杉醇的耐藥性比較也有顯著性差異(P＜0.05)。3組使用不同濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組間對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定量效關(guān)系，應(yīng)用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組其耐藥性產(chǎn)生較慢，即能相對地保持對紫杉醇的敏感性(P＜0.05)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度

A2780組中A2780原代細(xì)胞熒光強(qiáng)度為(98.1±1.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(82.4 ±2.1);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(72.7 ±3.2);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(54.2 ±2.9);單用紫杉醇組為(46.6±2.1)。skov3組中skov3原代細(xì)胞熒光強(qiáng)度為(93.6±2.3);紫杉醇 +10 μM RU486 組為(78.8 ±1.8);紫杉醇 +2.5 μM RU486 組為(63.3 ±4.5);紫杉醇 +1 μM RU486 組為(34.7 ±3.9)，單用紫杉醇組為(18.2±2.7)。因此，加入不同濃度米非司酮的誘導(dǎo)耐藥組與單純使用紫杉醇組熒光強(qiáng)度比較有顯著性差異(P＜0.05)。由此表明，不同濃度的米非司酮可以不同程度地增加羅丹明在A2780、skov3兩組細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

2.5 免疫組化SP染色結(jié)果

P-gp在A2780、skov3原代細(xì)胞中均無表達(dá);而在使用不同濃度米非司酮的各組細(xì)胞中均呈陽性表達(dá);在單用紫杉醇誘導(dǎo)的A2780、skov3細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。

2.6 Western Blotting法檢測P-gp蛋白定量

經(jīng)過紫杉醇的誘導(dǎo)后，加入不同劑量的米非司酮組均呈現(xiàn)P-gp表達(dá)，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達(dá)量與誘導(dǎo)同時(shí)加入米非司酮的濃度呈負(fù)相關(guān)，即米非司酮濃度越高則產(chǎn)生的P-gp量越少，見圖3、圖4，結(jié)果說明誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的同時(shí)加入米非司酮可減慢卵巢癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。

圖3 應(yīng)用紫杉醇后A2780各組P-gp含量

圖4 應(yīng)用紫杉醇后skov3各組P-gp含量

3 討論

卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后化療是目前治療卵巢癌的主要方法，由于卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)不易徹底切除的特點(diǎn)，化療在卵巢癌治療中起了極為重要的作用［1］。但隨著化療療程的增加，大部分化療患者出現(xiàn)了耐藥性，導(dǎo)致化療失敗，5年生存率無明顯改善，這些年來，MDR基因及其表達(dá)物P糖蛋白介導(dǎo)的多重耐藥是腫瘤細(xì)胞耐藥研究的熱點(diǎn)，MDR基因的表達(dá)與多種癌癥細(xì)胞化療耐藥相關(guān)［2］。P糖蛋白介導(dǎo)的多重耐藥是各類腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的經(jīng)典途徑，是目前研究相對較為深入，同時(shí)機(jī)理較為清晰的途徑。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞的多重耐藥的產(chǎn)生與MDR1基因擴(kuò)增，進(jìn)而使的MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄增加、P-gP產(chǎn)生及增多有關(guān)［3-4］;同時(shí)，另一些耐藥腫瘤細(xì)胞雖無MDR1基因擴(kuò)增，但卻有mRNA轉(zhuǎn)錄增加，最終使的P-gP表達(dá)增加［5］，抑制 MDR 的表達(dá)可以抑制耐藥性的產(chǎn)生［6］。同時(shí)，近年發(fā)現(xiàn)米非司酮等藥物對婦科惡性腫瘤的治療具有一定的潛力，作為逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物［7］，至今尚未成功用于臨床。因此，探討對卵巢癌常用藥物紫杉醇的耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)理就成了提高患者生存期的關(guān)鍵。米非司酮對耐藥的卵巢癌細(xì)胞有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，本實(shí)驗(yàn)旨在研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780、skov3的耐藥性產(chǎn)生過程中所起的作用，是否有降低其耐藥性產(chǎn)生速度的可能。

實(shí)驗(yàn)通過在紫杉醇誘導(dǎo)A2780、skov3產(chǎn)生耐藥過程同時(shí)使用不同濃度的米非司酮產(chǎn)生出各不同濃度的米非司酮與紫杉醇誘導(dǎo)后的A2780、skov3細(xì)胞亞株，觀察各細(xì)胞亞株P(guān)糖蛋白(P-gp)表達(dá)情況及各細(xì)胞亞株的P-gp的含量、檢測其生長曲線、IC50;以羅丹明123(Rh123)作為熒光探針觀察各細(xì)胞亞株胞內(nèi)羅丹明含量來研究米非司酮如何抑制紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株A2780、skov3的耐藥性的產(chǎn)生。結(jié)果顯示:①A2780、skov3細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞較誘導(dǎo)前變小，細(xì)胞有呈團(tuán)簇狀生長的趨勢。加用米非司酮的各組細(xì)胞也呈現(xiàn)出上述變化的特點(diǎn)，但加入米非司酮濃度大者細(xì)胞壞死出現(xiàn)的越明顯，其恢復(fù)對數(shù)生長期的時(shí)間越長。②兩組生長曲線檢測:使用紫杉醇沖擊法誘導(dǎo)體外卵巢癌細(xì)胞系(A2780、skov3)可以使細(xì)胞亞克隆的篩選傾向于生長周期長或分裂增殖相對不旺盛的亞群。加入米非司酮的濃度越大，篩選出的亞克隆生長越不活躍。③通過對半數(shù)致死濃度(IC50值)的測定，使用紫杉醇作為誘導(dǎo)劑后:首先各組細(xì)胞對于紫杉醇的耐藥性明顯提高，各組與原代A2780、skov3細(xì)胞對于紫杉醇的耐藥性有顯著性差異。其次，使用米非司酮的各組與不使用的陽性對照組對于紫杉醇的耐藥性也有顯著性差異。最后3組實(shí)驗(yàn)組對紫杉醇的耐藥性存在差異，而且有一定的量效關(guān)系，使用高濃度米非司酮的實(shí)驗(yàn)組耐藥性產(chǎn)生的較慢即能相對的保持對紫杉醇的敏感性。A2780、skov3兩組細(xì)胞表現(xiàn)出類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明化療同時(shí)使用非司酮能保持對卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。④應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測P-gp功能，羅丹明熒光強(qiáng)度說明在加入了不同濃度米非司酮后，在模擬臨床化療，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的過程中，米非司酮可以增加羅丹明在A2780、skov3兩組細(xì)胞內(nèi)的蓄積，并與其用量相關(guān)。這使得我們從功能上了解了米非司酮抑制耐藥性的可能機(jī)理應(yīng)該與減低細(xì)胞非特異性外排的機(jī)能高度相關(guān)。⑤免疫組化及Western Blotting結(jié)果顯示，使用紫杉醇誘導(dǎo)A2780組呈現(xiàn)出與紫杉醇誘導(dǎo)skov3組相似的結(jié)果，經(jīng)過紫杉醇的誘導(dǎo)后，加入不同劑量的米非司酮均有P-gp表達(dá)出現(xiàn)，且有一定的量效關(guān)系，P-gp表達(dá)量與誘導(dǎo)同時(shí)加入米非司酮的量呈負(fù)相關(guān)，即加入劑量越大的米非司酮?jiǎng)t產(chǎn)生的P-gp越少，這從機(jī)理上驗(yàn)證了由前面MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的、在誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的同時(shí)加入米非司酮，減慢了卵巢癌細(xì)胞的耐藥性的產(chǎn)生。

米非司酮對人耐藥卵巢癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。米非司酮抑制耐藥性表現(xiàn)應(yīng)該與減低細(xì)胞非特異性外排的機(jī)能有關(guān)，其對卵巢癌的治療具有進(jìn)一步的臨床研究價(jià)值。

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