ELISA法檢測干細(xì)胞溶液中殘留牛血清白蛋白含量

宛 瑩，聶德志＊ ，賁 亮，黃若洋

（1.四平中心人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平 136000；2.吉林省拓華生物科技有限公司，吉林 四平 136000）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，是造血微環(huán)境中一種重要細(xì)胞成分，目前臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞移植可用于組織的修復(fù)及治療間充質(zhì)組織遺傳缺陷性疾病，臨床應(yīng)用前景廣闊［1－4］。根據(jù)2013年國家《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的規(guī)定，干細(xì)胞治療作為一種新型的生物治療產(chǎn)品，所有干細(xì)胞制劑都可遵循一個共同的研發(fā)過程，即從干細(xì)胞制劑的制備、體外試驗(yàn)、體內(nèi)動物試驗(yàn)，到植入人體的臨床研究及臨床治療的過程。整個過程的每一階段，都須對所使用的干細(xì)胞制劑在細(xì)胞質(zhì)量、安全性和生物學(xué)效應(yīng)方面進(jìn)行相關(guān)的研究和質(zhì)量控制。

根據(jù)指導(dǎo)原則中的規(guī)定，在干細(xì)胞的采集、分離及干細(xì)胞（系）建立階段，除進(jìn)行細(xì)胞鑒別、成活率及生長活性檢測以外，還應(yīng)進(jìn)行全面的內(nèi)外源致病微生物、詳細(xì)的干細(xì)胞特性檢測，以及細(xì)胞純度分析。其中細(xì)胞內(nèi)外源性細(xì)胞因子的檢測項(xiàng)中明確提到如使用過牛血清，須進(jìn)行牛源特定病毒的檢測包括BSA殘留量檢測。而目前尚無對細(xì)胞產(chǎn)品牛血清白蛋白殘留量檢測的標(biāo)準(zhǔn)化方法，主要參照2010年版《中國藥典》三部附錄中牛血清白蛋白殘留量檢測方法的規(guī)定進(jìn)行，采用酶聯(lián)免疫法測定供試品中殘余牛血清白蛋白含量。本文采用酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞不同清洗程序和培養(yǎng)基條件中BSA殘留量的檢測，探討不同清洗程序?qū)?xì)胞產(chǎn)品中BSA殘留量的影響，從而為建立合理有效的清洗程序和檢測標(biāo)準(zhǔn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品與試劑

用于檢測的干細(xì)胞為臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞，足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，取自四平市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，進(jìn)行常規(guī)分離。選用流式細(xì)胞儀分析P5細(xì)胞檢測表型［5］。BSA殘留量檢測使用試劑盒為無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司的定量檢測牛血清白蛋白（BSA）酶聯(lián)免疫試劑盒，批號：20120602。

1.2 試劑 α－MEM 培養(yǎng) 基購自美國 Thermo Fisher公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，無血清培養(yǎng)基購自杭州百通生物科技有限公司。

1.3 方法 干細(xì)胞樣品制備見表1。

表1 干細(xì)胞樣品制備

1.4 ELISA法檢測BSA殘留的方法 將待測樣品與BSA標(biāo)準(zhǔn)品加入包被有BSA抗體的96孔板中，37℃孵育1小時，洗板并加入酶標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30 min；洗板后加入底物液并避光孵育10－15 min，加入終止液后輕輕震蕩，并在450 nm單波長下讀數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA）。數(shù)據(jù)采用 Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

h UMSCs自臍帶中分離培養(yǎng)，并傳至P3時形態(tài)學(xué)上顯示成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈漩渦樣生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測h UMSCs表達(dá)CD73，CD90和CD105；不表達(dá) CD34，CD45，CD14，CD19，HLADR［6］。ELISA酶聯(lián)檢測試劑盒測定方法計(jì)算結(jié)果顯示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)方程y＝0.0240x－0.0313，R2＝0.994 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。使用常規(guī)培養(yǎng)基α－MEM 10% 胎牛血清中培養(yǎng)傳至P5時，PBS清洗1次后干細(xì)胞溶液中殘留BSA為117.58 ng／ml，PBS清洗3次后干細(xì)胞溶液中BSA的殘留量下降為36.60 ng／ml。使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，樣品中BSA的殘留量隨著細(xì)胞的傳代次數(shù)至P5時有明顯的減少趨勢，從P3時的95.12 ng／ml下降到P5時的5.96 ng／ml。同時，凍存后的細(xì)胞樣品經(jīng)過復(fù)蘇后培養(yǎng)，BSA的殘留為24.65 ng／ml。計(jì)算結(jié)果見表1。

圖1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度繪制散點(diǎn)圖

表1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的測定樣品殘留的BSA含量

3 討論

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增過程中培養(yǎng)液的重要組分，是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，也是許多生物制品保存液中的必要組分之一。在牛血清中，BSA是牛血清中的主要成分（約為35－50 mg／ml），同時也是引起過敏反應(yīng)的最主要因素之一。BSA，作為異源蛋白的代表，能夠引起機(jī)體的多種免疫反應(yīng)［8－13］。因此，檢測BSA的殘留被作為國家對生物制品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

與其他生物制品不同，細(xì)胞產(chǎn)品的純化與清潔只能通過規(guī)范的清洗程序，以減低及清除對機(jī)體多種不利的影響因素，以達(dá)到國家對細(xì)胞制品的標(biāo)準(zhǔn)要求。通過本次試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至P5，PBS清洗3次后細(xì)胞中BSA殘留量可達(dá)到40 ng／ml以內(nèi)，而且采用無血清培養(yǎng)能從細(xì)胞培養(yǎng)的源頭有效地避免BSA的殘留，這對于提高細(xì)胞生物制品的生物安全性，推動干細(xì)胞生物產(chǎn)品走向規(guī)?；笆袌龌瑥亩行У卦旄Ｈ祟惤】稻哂兄匾饔?。

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