溫?zé)釋ξ赴㎝KN－45細(xì)胞凋亡及基因Bax表達(dá)的影響

蔣莉萍，邱 瑜，肖 鳳，吳鳳珍

（1.吉安市婦幼保健院 病理科，江西 吉安 343000；2.井岡山大學(xué) 病理教研室，江西 吉安 343000）

自從1975年在華盛頓召開的第一屆國際熱療會議以來，熱療作為一種新的腫瘤治療方法越來越引起人們的興趣與關(guān)注，唯獨(dú)熱療不開刀，無副作用，被譽(yù)為治療腫瘤的“綠色療法”。是繼臨床上常規(guī)抗癌療法之后的另一種新的抑癌方法［1，2］。目前研究認(rèn)為，溫?zé)岽碳つ芤鸺?xì)胞凋亡［3，4］，而且溫?zé)岑煼ê兔庖?、化療等療法?lián)合應(yīng)用，還會提高免疫，化療等療法的效果［5，6］。本研究對胃癌 MKN－45細(xì)胞采用臨床有效且相對安全的43℃作為溫?zé)岬臈l件，進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的水浴熱處理，旨在通過觀察溫?zé)嶙饔脤KN－45細(xì)胞凋亡及Bax基因表達(dá)的影響，為臨床溫?zé)岑煼ㄌ峁┮欢ǖ睦碚撘罁?jù)。

1 材料和器材

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株MKN－45胃癌細(xì)胞由江西省消化系疾病研究所饋贈；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；DMSO（美國Amresco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司KGA7031－50）；DEPC（美國 Amresco公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；700 bp DNA ladder Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Bax（上游5′－GGCCCACCAGCTCTGAGCAG－3′，下游5′－GCCACGTGGGCGTCCCAAAC－3′，575 bp）及β－actin（上游5′－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3′，下游5′－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3′，432 bp）PCR引物（美國Invitrogen公司）。

1.2 器材 超凈工作臺（新加坡ESCO公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；35 mm玻底培養(yǎng)皿（香港耐思科學(xué)有限責(zé)任公司）；RT－PCR電泳儀（美國Bio－rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（37℃、5%CO2飽和濕度）。

2.2 溫?zé)釋?shí)驗(yàn)

對照組37℃常規(guī)培養(yǎng)，不給予加熱處理，實(shí)驗(yàn)組加熱溫度設(shè)置43℃，根據(jù)加熱時(shí)間不同分為0.5 h、1 h、2 h及3 h。將處于對數(shù)生長期內(nèi)的MKN－45細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸混勻，計(jì)數(shù)后，接種于35 mm NEST培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)至貼壁。用封口膜封口后放入43℃的電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動(dòng)＜±0.1℃）。確保整個(gè)培養(yǎng)皿底部平放淹沒于水中，將溫?zé)崽幚砗蟮募?xì)胞換新鮮的10%FBS－高糖DMEM培養(yǎng)液，并放置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察各溫?zé)釙r(shí)間組胃癌細(xì)胞MKN－45的形態(tài)改變。

2.3 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡

按本實(shí)驗(yàn)2.2細(xì)胞樣品制備后，將自然晾干的細(xì)胞樣本（細(xì)胞爬片）浸入4%多聚甲醛固定液，室溫（25℃）固定30 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；樣本片浸入通透液中，室溫促滲5 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；樣本片浸入封閉液中，封閉10 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；每張樣本片上滴加100μl上述配制好的DNaseⅠ反應(yīng)液，25℃處理30 min，浸入1×PBS漂洗2次，每次5 min；每個(gè)樣本上滴加50μl Td T酶反應(yīng)液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)60 min，反應(yīng)連接后的樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，注意避光；每個(gè)樣本上滴加50μl Streptavidin－HRP工作液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)連接后的樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，DAB顯色。

凋亡細(xì)胞半定量分析：在普通光學(xué)顯微鏡下，每組培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，以計(jì)算平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。

2.4 RT－PCR法檢測溫?zé)岷笪赴┘?xì)胞Bax的mRNA表達(dá)

MKN－45細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁長至70%左右，分組溫?zé)崽幚砗?4 h，將溫?zé)崽幚砗蟮母鹘M細(xì)胞用預(yù)冷的PBS液洗3次，吸棄PBS液，依次加入Trizol、氯仿、異丙醇等，按常規(guī)抽提法提取細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RNA的完整性，紫外分光光度法確定RNA的量和純度。以總RNA為模板按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物與1μl 6×上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，50%甘油，10 m M EDTA）混合，加樣于含0.5%溴化乙錠的2%瓊脂凝膠，100 V電泳15 min，紫外線燈下觀察結(jié)果。然后用Quantity One4.6.2軟件分析灰度值，再計(jì)算灰度系數(shù)比。

3 結(jié)果

3.1 溫?zé)岷笪赴┘?xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變

倒置顯微鏡觀察：與對照組相比，溫?zé)?.5 h部分貼壁MKN－45細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，從胞膜伸出胞外的偽足逐漸減少，細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞內(nèi)顆粒成分逐漸增多，細(xì)胞漂浮，1 h相對較少，2 h細(xì)胞皺縮、變圓、漂浮明顯增多，細(xì)胞數(shù)目減少，3 h大部分細(xì)胞出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，提示溫?zé)?.5 h、1 h，2 h和3 h可明顯殺傷胃癌MKN－45細(xì)胞。

3.2 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況

利用TUNEL熒光素原位末端標(biāo)記技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色熒光，而非凋亡細(xì)胞不發(fā)黃綠色熒光，溫?zé)? h、0.5 h、1 h、2 h和3 h后 MKN－45細(xì)胞凋亡率分別為11.3%、42.7%、33.4%、48.8%、44.3%，各溫?zé)釙r(shí)間組 MKN－45細(xì)胞凋亡率均明顯高于0 h時(shí)間組細(xì)胞的凋亡率（P＜0.01），并且溫?zé)? h后的細(xì)胞凋亡率低于溫?zé)?.5 h，提示胃癌細(xì)胞自身對溫?zé)峥僧a(chǎn)生一定的應(yīng)激能力（表1，圖1）。

表1 不同溫?zé)釙r(shí)間組胃癌MKN－45細(xì)胞的凋亡率

圖1 不同溫?zé)釙r(shí)間組胃癌MKN－45細(xì)胞的TUNEL染色

3.3 RT－PCR法檢測Bax的mRNA表達(dá)

RT－PCR電泳結(jié)果顯示，與0 h對照組比較，0.5 h至3 h各溫?zé)釙r(shí)間組的細(xì)胞Bax的m RNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；3 h組達(dá)最高峰，1 h組低于0.5 h組；與TUNEL法測凋亡的趨勢相一致，提示溫?zé)峥赡苷T導(dǎo)胃癌MKN－45細(xì)胞促凋亡基因過程中Bax基因激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖2）。

圖2 不同溫?zé)釙r(shí)間組胃癌MKN－45細(xì)胞Bax m RNA的RT－PCR檢測（β－actin為內(nèi)參照）

3.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示（±SD），以單因素方差分析（one－way ANOVE）計(jì)算多組間差異，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 討論

熱療是用人工加熱的方法治療惡性腫瘤，利用各種物理能量在人體組織中產(chǎn)生熱效應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞升溫到一定程度并維持一定時(shí)間，達(dá)到引起癌細(xì)胞凋亡和殺滅癌細(xì)胞及避免正常細(xì)胞遭受損傷的目的，另外熱療可增強(qiáng)免疫治療和化學(xué)藥物治療的效果，所以在目前的腫瘤綜合治療中倍受關(guān)注。當(dāng)前研究表明，溫?zé)岑煼ㄖ委煇盒阅[瘤的作用機(jī)制主要是：1）改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，妨礙膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及細(xì)胞表面受體的功能，直接導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡；2）抑制腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移［7］；3）可促進(jìn)免疫細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成及增強(qiáng)免疫效應(yīng)，提高機(jī)體的免疫功能［8］；4）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。有研究表明43℃～45℃溫?zé)嶙饔每烧T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］，但不同類型的腫瘤細(xì)胞對熱療的反應(yīng)和敏感性也存在明顯差異［11］。本實(shí)驗(yàn)首先采用倒置顯微鏡觀察到溫?zé)岷驧KN－45細(xì)胞體積變小變圓，核膜皺縮，核染色質(zhì)均質(zhì)化，呈細(xì)顆粒狀，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)顆粒成分逐漸增多，細(xì)胞凋亡數(shù)增加。然后采用TUNEL法檢測溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌MKN－45細(xì)胞凋亡率情況，隨著溫?zé)釙r(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加，另外溫?zé)? h細(xì)胞活力比0.5 h時(shí)略高，提示 MKN－45細(xì)胞在熱刺激的持續(xù)作用下，很可能在1 h進(jìn)入一個(gè)熱適應(yīng)期。而3 h細(xì)胞組活力比2 h時(shí)略低，考慮隨著時(shí)間的延長，熱刺激3 h細(xì)胞組出現(xiàn)了大批細(xì)胞的死亡。

Bax是一種Bcl－2家族的前凋亡蛋白，而且是Bcl－2家族中最主要的凋亡基因。一般出現(xiàn)在胞漿中，并作為一種細(xì)胞損傷和刺激的傳感器。響應(yīng)損傷和刺激，Bax將重新定位于線粒體表面并破壞在正常狀態(tài)下抗凋亡的Bcl－2蛋白的功能，可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有促凋亡作用［12］。在本研究中，溫?zé)嶙鳛橐环N應(yīng)激，為此，我們推測Bax參與溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程。我們采用RT－PCR法檢測MKN－45細(xì)胞43℃溫?zé)嵯?.5 h、1 h、2 h和3 h后的Bax mRNA水平的表達(dá)情況。與對照組比較，MKN－45細(xì)胞各溫?zé)釙r(shí)間組Bax mRNA水平的表達(dá)明顯升高，溫?zé)? h組達(dá)最高峰，1 h組低于0.5 h組（P＜0.01）。這與前面的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。提示溫?zé)峥擅黠@抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可能是通過上調(diào)Bax水平的表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

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