KGF及KGFR共表達(dá)促進(jìn)鐵過(guò)載肝細(xì)胞增殖

安樹(shù)才，張智斌

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 甲狀腺外科，山東 青島 266003；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外一科，黑龍江 佳木斯 154002）

肝臟是鐵代謝的主要器官，大量鐵的吸收破壞了細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡導(dǎo)致鐵缺乏或鐵過(guò)載。鐵過(guò)載可引起肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化甚至肝硬化［1－2］，并和肝臟腫瘤發(fā)生相關(guān)［3－4］，在肝硬化和非肝硬化患者中鐵過(guò)載可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生［5］。另外，丙型肝炎病毒感染患者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的降鐵藥物治療后，可以使肝臟功能得到明顯改善［6－7］。有證據(jù)表明在感染HCV的年輕肝癌患者中鐵過(guò)載和肝癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系［8］。但是，鐵過(guò)載和肝細(xì)胞增殖之間的相關(guān)性尚不清楚。正常情況下肝細(xì)胞處于較慢的一個(gè)增殖狀態(tài)，但是在經(jīng)過(guò)諸如部分肝切除等各種損傷后，肝細(xì)胞再生被激活［9－10］，這為我們提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究鐵過(guò)載在肝細(xì)胞增殖中的作用。

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth facto，KGF）屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族，也叫FGF－7，來(lái)源于角質(zhì)形成細(xì)胞，是對(duì)上皮細(xì)胞具強(qiáng)促分裂原活性的一種生長(zhǎng)因子［11］。KGF和KGF受體（KGFR）相互結(jié)合參與細(xì)胞的增殖，而且KGFR特異性存在于上皮細(xì)胞內(nèi)［12］。KGF是一個(gè)重要的增殖和分化因子，并且在上皮細(xì)胞系促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)［13－15］，包括胃腸和肝臟細(xì)胞［16－17］。KGF在體內(nèi)和體外對(duì)肝細(xì)胞是一個(gè)強(qiáng)有力的促分裂素［16，18］。KGF 和KGFR在肝纖維化中出現(xiàn)共表達(dá)［19］，但是在鐵過(guò)載的情況下對(duì)肝細(xì)胞中的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在通過(guò)喂食大鼠3%羰基鐵的鐵過(guò)載動(dòng)物模型，70%部分肝切除來(lái)探討鐵過(guò)載在肝細(xì)胞中的KGF和KGFR的表達(dá)并探討其作用。

1 材料及方法

1.1 材料

多聚甲醛（POM）購(gòu)自德國(guó)默克公司，3，3’－二氨基聯(lián)苯胺－4－鹽酸（DAB）購(gòu)自日本Dojin化學(xué)制品公司，胎牛血清白蛋白（BSA）、正?？剐∈驣g G和抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，戊巴比妥購(gòu)自日本Dainippon制藥公司。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG F（ab）’購(gòu)自日本名古屋醫(yī)療生物實(shí)驗(yàn)室；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗生物素抗體購(gòu)自美國(guó)加利福尼亞伯靈格姆向量實(shí)驗(yàn)室；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的綿羊抗地高辛（1∶100）購(gòu)自羅氏公司。KGF和KGFR抗體由日本長(zhǎng)崎大學(xué)小路武彥教授提供。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的所有其他試劑購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 鐵過(guò)載大鼠肝臟部分切除模型制備

健康雄性 Wistar大鼠40只，每組5只，清潔級(jí)，7－8周齡，體重200－250 g，佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常組和實(shí)驗(yàn)組。正常組喂食普通食料，實(shí)驗(yàn)組喂食添加3%羰基鐵食料。各組喂食3個(gè)月后通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg／kg）進(jìn)行麻醉，待麻醉滿意后切開(kāi)腹腔顯露肝臟行70%肝臟部分切除術(shù)［20］。肝臟樣本在不同的時(shí)間點(diǎn)（0 h，12 h，24 h，36 h）離體，在4%磷酸鹽緩沖液（PBS）中4℃過(guò)夜固定、石蠟包埋。制備5－6μm厚度切片，部分用以HE染色進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。

1.3 方法

鐵在肝臟中沉積程度采用普魯士藍(lán)染色方法檢測(cè)，方法見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。KGF和KGFR采用酶聯(lián)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HRP的位點(diǎn)在鎳鈷鐵存在或不存在的情況下可以通過(guò)DAB和 H2O2可視化［21，22］。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中各陰性對(duì)照樣本與正常兔IgG反應(yīng)，而不是特異性一抗。

原位雜交方法：KGF和KGFR的探針?lè)謩e為No.648－683和 No.1388－1432［23］。然后在37℃和42℃條件下雜交過(guò)夜，使用的介質(zhì)中含有10 m M Tris－HCl（PH 7.4），1 m M 的乙二胺四乙酸，0.6 m M 的NaCl，1×Denhardt氏溶液，250 mg／ml酵母轉(zhuǎn)移核糖核酸，125 mg／ml鮭魚(yú)睪丸DNA，10%硫酸葡聚糖，200 U／ml的肝素，10 mg／ml多聚腺苷酸鉀的鹽，40%去離子甲酰胺和2 mg／ml－T二聚的KGF探針或T－T二聚KGFR探針。雜交后將切片在37℃下，在2xSSC／50% 甲酰胺／0.075%Brij 35中洗滌3次，再在37℃下，在0.5xSSC／50% 甲酰胺／0.075%Brij 35中洗滌1小時(shí)，最后在室溫下，在2xSSC中洗滌15分鐘。切片行酶學(xué)免疫組化處理。將切片在封閉液（封閉液中成分：PBS中加入5%BSA，0.3 m M 的 NaCl，100 mg／ml鮭魚(yú)睪丸DNA，100 mg／ml酵母轉(zhuǎn)移RNA，和500 mg／ml正常小鼠IgG）中室溫條件下孵化1小時(shí)，然后切片在室溫下，與1：80的HRP小鼠抗T－T－G抗體反應(yīng)過(guò)夜。在PBS中用0.075%Brij 35洗滌后，用過(guò)氧化氫和DAB將HRP位點(diǎn)進(jìn)行可視化處理。通過(guò)染色密度來(lái)評(píng)價(jià)陽(yáng)性細(xì)胞，該染色密度是使用圖像分析儀，通過(guò)測(cè)量正義探針染色水平來(lái)確定的。通過(guò)多種對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)特異性mRNA信號(hào)。每次實(shí)驗(yàn)中，正義探針都作為陰性對(duì)照。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用28S r RNA探針作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)評(píng)估組織切片中雜交RNA的水平。此外，為了提供確鑿證據(jù)，用一些切片在過(guò)量未標(biāo)記反義探針或正義探針中與反義探針雜交，來(lái)證明前面提到的信號(hào)序列的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SE表示，非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)顯著性分析。P≤0.05代表有顯著性差異。所有分析均以數(shù)據(jù)分析包（Stat－View，version 5.0；Abacus Concepts，Berkeley，CA，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 鐵沉積

正常組在各個(gè)時(shí)間均未檢測(cè)到鐵的沉積。實(shí)驗(yàn)組在0小時(shí)發(fā)現(xiàn)位于肝小葉中央靜脈中央帶的肝細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖1D），12 h發(fā)現(xiàn)在中央帶的肝細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)（圖1F），并隨時(shí)間鐵沉積的表達(dá)逐漸減弱（圖1 H）。

2.2 KGF和KGFR蛋白的表達(dá)

KGF在正常組從12 h肝小葉中央靜脈周?chē)螌?shí)質(zhì)細(xì)胞和肝間質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，到36 h這種表達(dá)達(dá)到最強(qiáng)（圖2 E）。實(shí)驗(yàn)組12 h同樣檢測(cè)出KGF表達(dá)，到24 h這種表達(dá)最為顯著（圖2 F）。KGFR的表達(dá)在正常組中0 h肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)，并隨時(shí)間增加而逐漸增強(qiáng)，到36 h達(dá)到高峰（圖3 E）。實(shí)驗(yàn)組0 h只檢測(cè)出少量KGFR陽(yáng)性細(xì)胞，到24 h達(dá)到最高隨后減少（圖3 F）。

圖1 各個(gè)時(shí)間段肝臟中鐵沉積。正常組（A，C，E，G）；實(shí)驗(yàn)組（B，D，F(xiàn)，H），黑色箭頭為肝臟中鐵沉積細(xì)胞。標(biāo)尺：50μm。

圖2 各個(gè)時(shí)間段肝臟中KGF陽(yáng)性細(xì)胞。正常組（A，C，E）；實(shí)驗(yàn)組（B，D，F(xiàn)），黑色箭頭為肝臟中KGF陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：50μm

圖3 各個(gè)時(shí)間段肝臟中KGFR陽(yáng)性細(xì)胞。正常組（A，C，E）；實(shí)驗(yàn)組（B，D，F(xiàn)），黑色箭頭為肝臟中KGF陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：50μm。

2.3 KGF和KGFR mRNA的表達(dá)

正常組KGF mRNA在肝細(xì)胞中只有少量的表達(dá)（圖4 A），在實(shí)驗(yàn)組中這種表達(dá)增加（圖4 C）。在實(shí)驗(yàn)組24 h KGF mRNA的表達(dá)達(dá)到最高（圖4 G），這種表達(dá)最重要是在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞核中。同樣的KGFR mRNA的表達(dá)和KGF mRNA表達(dá)是一致的（圖5）。

3 討論

肝臟中的鐵沉積在肝切除術(shù)后迅速減弱，使得12－36 h肝竇部的肝細(xì)胞鐵沉積明顯，這與運(yùn)用鐵螯合劑治療小鼠幼鼠血色素沉積癥相似［24］。盡管本研究并未探討原因，但肝細(xì)胞中的鐵代謝在再生過(guò)程中是發(fā)生改變的。我們的實(shí)驗(yàn)證明在肝切除實(shí)驗(yàn)組24 h KGF和KGFR的蛋白水平和mRNA的表達(dá)同一時(shí)間到達(dá)最高，比正常組提前12 h。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、紅細(xì)胞生成素（erythropoietin）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對(duì)再生改善、組織重構(gòu)和肝細(xì)胞復(fù)制有影響。然而，盡管VEGF被認(rèn)為參與血管生長(zhǎng)以及肝細(xì)胞增殖，但是VEGF并未被驗(yàn)證誘導(dǎo)肝再生［10］。相似的，盡管報(bào)導(dǎo)肝再生時(shí)紅細(xì)胞生成素的合成增加，但其在肝再生中的作用尚存在爭(zhēng)議［25］。因?yàn)楦闻K細(xì)胞外基質(zhì)是多種生長(zhǎng)因子（如HGF和肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子等）的儲(chǔ)存器，所以在組織重構(gòu)的過(guò)程中組織基質(zhì)的降解是必要的。事實(shí)上，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到MMP－14和它的組織抑制劑（TIMP－1）在肝臟再生的早期階段即可被特異性誘導(dǎo)，然而，它們?cè)诟闻K再生誘導(dǎo)中的作用尚未證實(shí)［26］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－α（TGF－α）參與肝細(xì)胞再生，但是確切的機(jī)理尚不清楚［27］。我們先前的研究證實(shí)在鐵過(guò)載的情況下NF－KB參與了肝細(xì)胞增生［22］。KGF存在于間質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞中，并且可以在上皮細(xì)胞中表達(dá)，KGF和KGFR的特異性結(jié)合引起細(xì)胞的增殖。KGF在慢性肝病中的星狀細(xì)胞中有表達(dá)［28］，KGF和KGFR在肝纖維化中共表達(dá)［19］，但是在鐵過(guò)載的情況下對(duì)肝細(xì)胞的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)證明KGF和KGFR在肝細(xì)胞中蛋白和mRNA同時(shí)表達(dá)，并且在實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)達(dá)到最大，比正常組提前，并且在先前的研究中已經(jīng)證明在這個(gè)時(shí)段細(xì)胞數(shù)和肝臟重量有顯著意義增加，證明KGF和KGFR參與肝細(xì)胞再生。KGF可以通過(guò)NF－KB的調(diào)節(jié)改變其表達(dá)［29］，但是確切的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。我們推測(cè)由于嚴(yán)重鐵沉積所維持的NF－κB激活KGF和KGFR共表達(dá)，可能繞過(guò)了肝切除后通常的肝臟再生通道順序引起肝細(xì)胞的增生。

圖4 各個(gè)時(shí)間段肝臟中KGF mRNA表達(dá)。正常組（A，C，E，G）；實(shí)驗(yàn)組（B，D，F(xiàn)，H），黑色箭頭為肝臟中 KGFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：50μm。

圖5 各個(gè)時(shí)間段肝臟中KGFR mRNA表達(dá)。正常組（A，C，E，G）；實(shí)驗(yàn)組（B，D，F(xiàn)，H），黑色箭頭為肝臟中 KGFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：50μm。

［1］Pietrangelo A，Rocchi E，Schiaffonati L，et al.Liver gene expression during chronic dietary iron overload in rats［J］.Hepatology，1990，11：798.

［2］Hentze MW，Muckenthaler MU，Andrews NC.Balancing acts：molecular control of mammalian iron metabolism［J］.Cell，2004，117：285.

［3］Turlin B，Juguet F，Moirand R，et al.Increased liver iron stores in patients with hepatocellular carcinoma developed on a noncirrhotic liver［J］.Hepatology，1995，22：446.

［4］Kowdley KV.Iron，hemochromatosis，and hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2004，127：S79.

［5］Di Bisceglie AM.Hepatitis C and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，1997，26：34S.

［6］Kato J，Kobune M，Nakamura T，et al.Normalization of elevated hepatic 8－h(huán)ydroxy－20－deoxyguanosine levels in chronic hepatitis C patients by phlebotomy and low iron diet［J］.Cancer Res，2001，61：8697.

［7］Yano M，Hayashi H，Yoshioka K，et al.A significant reduction in serum alanine aminotransferase levels after 3－month iron reduction therapy for chronic hepatitis C：a multicenter，prospective，randomized，controlled trial in Japan［J］.J Gastroenterol，2004，39：570.

［8］Soe K，Hishikawa Y，F(xiàn)ukuzawa Y，et al.Possible correlation between iron deposition and enhanced proliferating activity in hepatitis C virus－positive hepatocellular carcinoma in Myanmar（Burma）［J］.J Gastroenterol，2007，42：225.

［9］Fausto N，Campbell JS，Riehle KJ.Liver regeneration［J］.Hepatology，2006，43：S45.

［10］Michalopoulos GK.Liver regeneration［J］.J Cell Physiol，2007，213：286.

［11］Rubin JS，Osada H，F(xiàn)inch PW，et al.Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86：802.

［12］Miki T，F(xiàn)leming TP，Bottaro DP，et al.Expression cDNA cloning of the KGF receptor by creation of a transforming autocrine loop［J］.Science，1991，251：72.

［13］Tamaru N，Hishikawa Y，Ejima K，et al.Estrogen receptor－associated expression of keratinocyte growth factor and its possible role in the inhibition of apoptosis in human breast cancer［J］.Lab Invest，2004，84：1460.

［14］Yamayoshi T，Nagayasu T，Matsumoto K，et al.Expression of keratinocyte growth factor／fibroblast growth factor－7 and its receptor in human lung cancer：correlation with tumour proliferative activity and patient prognosis［J］.J Pathol，2004，204：110.

［15］Yamamoto S，Asanuma T，Takagi T，et al.The molecule role ontology：an ontology for annotation of signal transduction pathway molecules in the scientific literature［J］.Comp Funct Genomics，2004；5：528.

［16］Housley RM，Morris CF，Boyle W，et al.Keratinocyte growth factor induces proliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gastrointestinal tract［J］.J Clin Invest，1994，94：1764.

［17］Bosch A，McCray PB Jr，Chang SM，et al.Proliferation Induced by Keratinocyte Growth Factor Enhances In Vivo Retroviralmediated Gene Transfer to Mouse Hepatocytes［J］.J Clin Invest，1996，98：2683.

［18］Strain AJ，McGuinness G，Rubin JS，et al.Keratinocyte growth factor and fibroblast growth factor action on DNA synthesis in rat and human hepatocytes：modulation by hepar－in［J］.Exp Cell Res，1994，210：253.

［19］Otte JM，Schwenger M，Brunke G，et al.Differential regulated expression of keratinocyte growth factor and its receptor in experimental and human liver fibrosis［J］.Regul Pept，2007，144：82.

［20］Higgins GM，Anderson RM.Experimental pathology of theliver.1.Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal［J］.Arch Pathol，1931，12：186.

［21］An S，Hishikawa Y，Liu J，et al.Lung injury after ischemiareperfusion of small intestine in rats involves apoptosis of type II alveolar epithelial cells mediated by TNF－alpha and activation of Bid pathway［J］.Apoptosis，2007，12：1989.

［22］An S，Soe K，Akamatsu M，et al.Accelerated proliferation of hepatocytes in rats with iron overload after partial hepatectomy［J］.Histochem Cell Biol，2012，138：773.

［23］Tamaru N，Hishikawa Y，Ejima K，et al.Estrogen receptor－associated expression of keratinocyte growth factor and its possible role in the inhibition of apoptosis in human breast cancer［J］.Lab Invest，2004，84：1460.

［24］Nick H，Allegrini PR，F(xiàn)ozard L，et al.Deferasirox reduces iron overload in a murine model of juvenile hemochromatosis［J］.Exp Biol Med（Maywood），2009，234：492.

［25］Bader A，Pavlica S，Deiwick A，et al.Proteomic analysis to display the effect of low doses of erythropoietin on rat liver regeneration［J］.Life Sci，2011，89：827.

［26］Knittel T，Mehde M，Grundmann A，et al.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors during hepatic tissue repair in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2000，113：443.

［27］Loyer P，Cariou S，Glaise D，et al.Growth factor dependence of progression through G1 and S phases of adult rat hepatocytes in vitro.Evidence of a mitogen restriction point in mid－late G1［J］.J Biol Chem，1996，271：11484.

［28］Steiling H，Wüstefeld T，Bugnon P，et al.Fibroblast growth factor receptor signalling is crucial for liver homeostasis and regeneration［J］.Oncogene，2003，22：4380.

［29］Li Y，Rinehart CA .Regulation of keratinocyte growth factor expression in human endometrium：implications for hormonal carcinogenesis［J］.Mol Carcinog，1998，23：217.