用于蘋果酒釀造的裂殖酵母生長及耐受性

何 丹，孫 玉 梅，欒 靜，楊 豐 旭

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

酵母菌廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)。在發(fā)酵過程中，酵母菌的代謝活動(dòng)不斷改變著其所處環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞暴露在諸如熱、氧化、滲透壓、酒精濃度等各種壓力條件下［1］，從而降低細(xì)胞的增長速率，影響細(xì)胞的活性。為保證發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，酵母細(xì)胞不僅要感應(yīng)這些壓力，而且還要迅速做出反應(yīng)，并最終適應(yīng)，以保持其代謝活性［2］。

在果酒釀造過程中，酵母面臨的主要壓力是滲透壓和酒精。發(fā)酵早期較高濃度的糖使?jié)B透壓升高，細(xì)胞受高滲刺激而迅速排出水分，出現(xiàn)收縮現(xiàn)象［3］。發(fā)酵后期積累的酒精能夠抑制細(xì)胞的生長和活性，影響糖和氨基酸等幾個(gè)運(yùn)輸途徑［4］。果酒釀造過程中的主要揮發(fā)酸——乙酸也能影響酵母菌的生長及新陳代謝。體積分?jǐn)?shù)為0.05%～0.1%乙酸可以降低細(xì)胞生長速率、糖消耗速率和乙醇產(chǎn)量［5］。適量加入二氧化硫可有效殺滅果汁中的雜菌，保證發(fā)酵正常進(jìn)行，因此需要酵母能夠耐受一定濃度的二氧化硫［6］。目前關(guān)于黃酒工業(yè)常用的釀造酵母、藍(lán)靛果酒酵母的耐受性及從草莓中篩選出的裂殖酵母的發(fā)酵特性已有相關(guān)報(bào)道［7－9］，而對(duì)果酒釀造過程中裂殖酵母的耐受性研究至今尚未見報(bào)道。

作者研究了實(shí)驗(yàn)室自篩的裂殖酵母菌在蘋果汁中的生長特性及耐受性，以期為裂殖酵母菌應(yīng)用于果酒生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大湖100%原榨蘋果汁，購于沃爾瑪超市；葡萄糖（AR），成都化學(xué)試劑廠；無水乙醇（AR），天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀（AR），北京化工廠；冰乙酸（AR），大連無機(jī)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHP－150生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS－3C精密pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；WYT－5手持糖量折光儀，上海大慶光學(xué)儀器廠；RJ－TDL－5A 低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，無錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.3 菌 種

裂殖酵母菌：本實(shí)驗(yàn)室保存，從草莓中分離而得［9］。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂20g／L，pH 6.0。

一級(jí)種子培養(yǎng)基（YPD）：酵母浸粉10g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，pH 6.0。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：大湖100%原榨蘋果汁，加入12.8g／L酵母浸粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大湖100%原榨蘋果汁，pH 3.58，糖度13.5°Brix。

以上培養(yǎng)基均在115℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 菌種的保存及活化

裂殖酵母在4℃保存于斜面培養(yǎng)基。取4℃保存的菌種，接種于斜面培養(yǎng)基，于30 ℃活化培養(yǎng)24h。

1.5.2 種子制備

一級(jí)種子：取斜面活化的菌種培養(yǎng)物2環(huán)，接入10mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中（15 mm×150 mm試管），于30 ℃靜置培養(yǎng)24h。

二級(jí)種子：按5%的體積比將一級(jí)種子液接入100mL二級(jí)種子培養(yǎng)基中（250mL 三角瓶），于30 ℃、160r／min搖床培養(yǎng)14h。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 生長曲線的測定

于10mL發(fā)酵培養(yǎng)基（15 mm×150 mm 試管）接入5%二級(jí)種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定菌體密度。

1.6.2 葡萄糖耐受性的測定

調(diào)YPD 培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度分別為100、140、180、220、260g／L。分裝10mL 不同葡萄糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基于試管（15 mm×150mm）中，滅菌冷卻后分別接入5%二級(jí)種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.3 酒精耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的無水乙醇，調(diào)整酒精體積分?jǐn)?shù)分別為0、3%、6%、9%、12%、15%、18%。10mL不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150mm 試管）分別接入5%二級(jí)種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h 的菌濃度。

1.6.4 二氧化硫耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的偏重亞硫酸鉀，調(diào)整SO2質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200mg／L。于10mL 不同SO2質(zhì)量濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150mm 試管）分別接入5%二級(jí)種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.5 乙酸耐受性的測定

向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的冰醋酸，調(diào)整乙酸體積分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%、4%。于10mL 不同乙酸體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（15mm×150 mm 試管）分別接入5%二級(jí)種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，并測定培養(yǎng)48h的菌濃度。

1.6.6 菌體密度的測定

采用比濁法于550nm 測定菌體密度［10］。取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液10mL，4 000r／min離心8min，以上清液為對(duì)照，利用分光光度計(jì)測定發(fā)酵液的濁度。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖酵母的生長曲線

裂殖酵母的生長曲線如圖1所示。由圖1可見，裂殖酵母在培養(yǎng)0～3h的菌體密度基本保持不變，細(xì)胞處于生長延滯期；3～36h菌體密度急劇上升；36h 后細(xì)胞進(jìn)入生長穩(wěn)定期，并且培養(yǎng)36～48h時(shí)菌體達(dá)到最大生長；48h后進(jìn)入衰亡期。

圖1 裂殖酵母的生長曲線（30 ℃）Fig.1 Growth curve of the Schizosaccharomyces in apple juice at 30 ℃

2.2 裂殖酵母的葡萄糖耐受性

表1與圖2分別為裂殖酵母在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度YPD 中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中ρG表示YPD 中初始葡萄糖的質(zhì)量濃度。由表1和圖2可知，在不同ρG的YPD 中，裂殖酵母培養(yǎng)24h后均可發(fā)酵，隨著ρG的增加，起酵時(shí)間延長，生長受到的ρG作用也增強(qiáng)。與ρG為100g／L 相比，裂殖酵母在ρG高于180g／L YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～36h的產(chǎn)氣量明顯減少，培養(yǎng)48h 的菌體密度下降40%。

這是因?yàn)檩^高葡萄糖質(zhì)量濃度導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓升高，引起細(xì)胞內(nèi)水分流失，生存能力下降。有研究表明，細(xì)胞通過HOG－MAPK 途徑，促進(jìn)甘油的積累及調(diào)節(jié)其他生理活動(dòng)，暫時(shí)停止生長，以抵抗應(yīng)激。高滲透壓還能誘導(dǎo)與糖代謝、戊糖磷酸途徑相關(guān)的基因表達(dá)，抑制與嘌呤、嘧啶、組氨酸和賴氨酸生物合成相關(guān)的基因表達(dá)，致使細(xì)胞的生長、代謝出現(xiàn)暫時(shí)性紊亂［11］。

表1 裂殖酵母在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度YPD 中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.1 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in YPD with different initial concentration of glucose

圖2 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.2 Effect of the initial glucose concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.3 裂殖酵母的酒精耐受性

表2與圖3分別為裂殖酵母在不同初始酒精體積分?jǐn)?shù)13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中φA表示13.5°Brix蘋果汁中初始酒精體積分?jǐn)?shù)。由表2和圖3可知，裂殖酵母對(duì)高體積分?jǐn)?shù)酒精較為敏感，當(dāng)φA高于6%時(shí)，產(chǎn)氣量、細(xì)胞生長速率和存活率減小程度較大，說明它不能耐受6%以上的酒精。酒精對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用很復(fù)雜，主要影響細(xì)胞生長、存活性和發(fā)酵力［12］。它能改變細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架疏散，周期延長，從而抑制酵母菌的生長［13］。酒精還能改變細(xì)胞膜成分及完整性，影響膜攝取營養(yǎng)和向外排出酒精的能力，導(dǎo)致酵母細(xì)胞代謝不平衡［14］，進(jìn)一步影響產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量。

表2 裂殖酵母在不同初始酒精體積分?jǐn)?shù)蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.2 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of alcohol

圖3 初始酒精體積分?jǐn)?shù)對(duì)裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.3 Effect of the initial alcohol concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.4 裂殖酵母的二氧化硫耐受性

表3與圖4分別為裂殖酵母在不同初始二氧化硫質(zhì)量濃度13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中ρ（SO2）表示13.5°Brix蘋果汁中初始二氧化硫質(zhì)量濃度。由表3和圖4可知，與不加二氧化硫相比，裂殖酵母在ρ（SO2）超過0.15g／L的蘋果汁中培養(yǎng)24～48h的產(chǎn)氣量無顯著變化，培養(yǎng)48h的菌體密度下降30%，說明此濃度的二氧化硫僅抑制了裂殖酵母的生長而沒有抑制其代謝活性。

二氧化硫?qū)频纳锘瘜W(xué)性質(zhì)有積極的穩(wěn)定作用。它不僅可以防止酒體的氧化和變色，而且能夠抑制細(xì)菌和非釀酒酵母的活動(dòng)。歐洲規(guī)定成品酒中二氧化硫的最高限量為0.2g／L。在果酒釀造過程中，二氧化硫通常以偏重亞硫酸鉀的形式加入到果汁中，而其主要通過與細(xì)胞化合物（尤其是羰基）反應(yīng)發(fā)揮它的毒性，產(chǎn)生的乙醛將作為第二重阻力進(jìn)一步抑制酵母的生長與發(fā)酵［15］。

表3 裂殖酵母在不同初始二氧化硫質(zhì)量濃度蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.3 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of sulfur dioxide

圖4 初始二氧化硫質(zhì)量濃度對(duì)裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.4 Effect of the initial sulfur dioxide concentration on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

2.5 裂殖酵母的乙酸耐受性

表4與圖5分別為裂殖酵母在不同初始乙酸體積分?jǐn)?shù)13.5°Brix蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣和生長情況，其中φAA表示13.5°Brix蘋果汁中初始乙酸體積分?jǐn)?shù)。由表4和圖5可知，裂殖酵母對(duì)乙酸比較敏感，1%乙酸嚴(yán)重抑制了裂殖酵母的生長與發(fā)酵。乙酸影響酵母菌的生長與代謝主要原因?yàn)椋阂宜嵬ㄟ^擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)較高的pH 使乙酸離解，導(dǎo)致胞內(nèi)pH 降低，以至低于正常的生理值，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)解折疊和細(xì)胞凋亡［16］；乙酸也能直接影響酶的活性（如糖酵解的關(guān)鍵酶），進(jìn)一步影響酵母菌的代謝活性［17］。

表4 裂殖酵母在不同初始乙酸體積分?jǐn)?shù)蘋果汁中的發(fā)酵產(chǎn)氣情況Tab.4 CO2 productivity of Schizosaccharomyces in apple juice with different initial concentration of acetic acid

圖5 初始乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)裂殖酵母生長（培養(yǎng)48h）的影響Fig.5 Effect of the initial concentration of acetic acid on Schizosaccharomyces growth at 48hcultivation

3 結(jié) 論

通過產(chǎn)氣和細(xì)胞生長情況分析了裂殖酵母的耐受性。結(jié)果顯示，裂殖酵母分別在YPD 初始葡萄糖質(zhì)量濃度超過180g／L、13.5°Brix蘋果汁初始酒精體積分?jǐn)?shù)超過6%或乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%條件下的生長及發(fā)酵受到強(qiáng)烈的抑制，而0.2g／L二氧化硫?qū)ζ湟种谱饔幂^弱。根據(jù)抵抗外界壓力的能力，裂殖酵母適用于中、低糖度（可溶性固形物15.0°Brix左右）果汁的果酒釀造。在果酒工業(yè)中，大多數(shù)國家將0.2g／L 二氧化硫作為最高允許添加量，因此實(shí)驗(yàn)室所用裂殖酵母在二氧化硫耐受能力方面能夠滿足生產(chǎn)要求。關(guān)于裂殖酵母酒精發(fā)酵過程的生理學(xué)機(jī)制及發(fā)酵應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

［1］IVORRA C，PéREZ－ORTíN J E，OLMO M.An inverse correlation between stress resistance and stuck fermentations in wine yeasts.A molecular study［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，64（6）：698－708.

［2］QUEROL A，F(xiàn)ERNáNDEZ－ESPINAR M T，OLMO M，et al.Adaptive evolution of wine yeast［J］.International Journal of Food Microbiology，2003，86（1／2）：3－10.

［3］CHEN R E，THORNER J.Function and regulation in MAPK signaling pathways：Lessons learned from the yeastSaccharomycescerevisiae［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2007，1773（8）：1311－1340.

［4］AGUILERA F，PEINADO R A，MILLáN C，et al.Relationship between ethanol tolerance，H＋－ATPase activity and the lipid composition of the plasma membrane in different wine yeast strains［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，110（1）：34－42.

［5］NARENDRANATH N V，THOMAS K C，INGLEDEW W M.Effects of acetic acid and lactic acid on the growth ofSaccharomycescerevisiaein a minimal medium［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆Biotechnology，2001，26（3）：171－177.

［6］杜金華，金玉紅.果酒生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：48－59.

［7］金耀光，范文來，徐巖.黃酒釀造酵母耐受性能的研究［J］.釀酒科技，2008（6）：17－21.

［8］孫廣仁，張啟昌，董鳳英，等.藍(lán)靛果酒酵母發(fā)酵特性的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（23）：305－309.

［9］呂慧威，孫玉梅，盧明春，等.自選酵母菌株草莓酒發(fā)酵特性比較［J］.食品科學(xué)，2010，31（11）：197－201.

［10］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：高等教育出版社，1999：95－96.

［11］JIMéNEZ－MARTí E，ZUZUARREGUI A，GOMAR－ALBA M.Molecular response ofSaccharomycescerevisiaewine and laboratory strains to high sugar stress conditions［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：211－220.

［12］張秋美，趙心清，姜如嬌，等.釀酒酵母乙醇耐性的分子機(jī)制及基因工程改造［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（4）：481－487.

［13］DINH T N，NAGAHISA K，HIRASAWA T，et al.Adaptation ofSaccharomycescerevisiaecells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size［J］.Public Library of Science One，2008，3（7）：1－7.

［14］MANNAZZU I，ANGELOZZI D，BELVISO S.Behaviour ofSaccharomycescerevisiaewine strains during adaptation to unfavourable conditions of fermentation on synthetic medium：Cell lipid composition，membrane integrity，viability and fermentative activity［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，121（1）：84－91.

［15］CLEMENTE JIMENEZ J M，MINGORANCE CAZORLA L，MARTíNEZ RODRíGUEZ S，et al.Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，98（3）：301－308.

［16］OLIVA J M，NEGRO M J，SáEZ F，et al.Effects of acetic acid，furfural and catechol combinations on ethanol fermentation ofKluyveromycesmarxianus［J］.Process Biochemistry，2006，41（5）：1223－1228.

［17］SOLIERI L，GIUDICI P.Yeasts associated to traditional balsamic vinegar：ecological and technological features［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，125（1）：36－45.