響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝研究

豆亞靜，張曉龍，常麗新，閆金萍，吳 丹

(1.河北聯(lián)合大學(xué)輕工學(xué)院，河北唐山063000; 2.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000)

黑豆，為豆科植物大豆的干燥種子，兼有藥食兩用的作用。我國(guó)各地均有栽培，尤以山西、河北、陜西較多。黑豆含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、胡蘿卜素、微量元素和粗纖維?！侗静菥V目拾遺》記載黑豆“服之能益精補(bǔ)髓，壯力潤(rùn)肌，發(fā)白后黑，久則轉(zhuǎn)老為少，終其身無(wú)病”?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明黑豆具有降血脂、抗氧化、養(yǎng)顏美容的效果［1］。異黃酮是黃酮類化合物中的一種，主要存在于豆科植物中。大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。20世紀(jì)90年代，對(duì)大豆異黃酮的研究成為世界性的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮具有防止骨質(zhì)疏松癥、抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病、改善婦女更年期綜合癥及雌激素樣等作用［2］。超聲波法是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用、擴(kuò)散、熱效應(yīng)以及空化作用加速生物細(xì)胞中有效成分的擴(kuò)散和浸出。具有提取時(shí)間短、有效成分提取率高、成本低、低溫保護(hù)熱敏性成分、污染小等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于黑豆異黃酮的研究報(bào)道極少，本文以乙醇作為溶劑，采用超聲波法通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，考察了影響黑豆異黃酮提取的因素，確定了最佳提取工藝。并與振蕩提取法進(jìn)行了比較，同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地黑豆異黃酮的含量，探索不同品種黑豆的黑豆異黃酮提取量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆 產(chǎn)自吉林、河北、陜北、江西、山東等地黑豆洗凈在60～65℃烘干粉碎過(guò)篩分為20、40、60、80、100、120目備用;金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品 洛陽(yáng)市創(chuàng)偉化玻有限公司;95%乙醇 天津市永大化學(xué)試劑公司。

722型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;BS-124S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;101-1AB型干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SK5210HP型超聲波清洗器 上?？等A生化儀器制造廠;KDF-2311型多功能食品粉碎機(jī) 天津市達(dá)康電器有限公司;標(biāo)準(zhǔn)分析篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆異黃酮工藝流程圖 黑豆粉末→乙醇浸泡→超聲波提取→過(guò)濾→測(cè)定異黃酮含量

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg，用95%乙醇溶解，定容至50m L容量瓶中。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50m L的溶液于10m L容量瓶中，再分別加入5.0m L 95%乙醇，然后用蒸餾水定容。在波長(zhǎng)259nm下測(cè)定吸光度。以金雀異黃酮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=1606.9966X-0.013 (R2=0.9980)

1.2.3 異黃酮提取率的計(jì)算 黑豆異黃酮提取液在波長(zhǎng)259nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得異黃酮的濃度［3］。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以乙醇濃度、粒度、液料比、提取時(shí)間、溫度、提取次數(shù)為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響。

稱取8份粒度為80目的黑豆粉5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，然后在50℃下超聲處理20min。

稱取顆粒粒度為20、40、60、80、100、120目黑豆粉各5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡 2h，然后在 50℃下超聲處理20m in。

稱取9份100目黑豆粉5.0000g，按液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡 2h，然后在 50℃下超聲處理20m in。

稱取7份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在溫度20、30、40、50、60、70℃，超聲處理20m in。

稱取6份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在50℃超聲處理10、20、30、40、50、60m in。

稱取 100目黑豆粉 5.0000g，按液料比 45∶1 (m L/g)加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在50℃超聲處理50m in，冷卻，過(guò)濾，再同樣條件下分別超聲處理1、2、3、4、5次。

1.2.5 響應(yīng)面分析 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇液料比、提取時(shí)間、溫度進(jìn)行三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1，利用Design-expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳工藝參數(shù)。

表1 三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，黑豆異黃酮的提取率隨之增加。在乙醇濃度高于60%以后曲線平緩，提取率的增加相對(duì)較小。因?yàn)辄S酮類化合物易溶于乙醇，乙醇濃度高有利于顆粒中物質(zhì)滲透溶解，而乙醇濃度過(guò)大時(shí)，蛋白質(zhì)，糖類等易溶于水的大分子會(huì)在乙醇溶液中發(fā)生凝聚，使提取液變稠，影響了黃酮的快速擴(kuò)散溶出，提取率的增加減少。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇60%為最適乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrations on yield of isoflavone from black soybean

2.1.2 顆粒粒度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖2可以看出，隨著粒度增加，黑豆異黃酮提取率也隨之增加，粒度為100目時(shí)，異黃酮提取率最大;粒度大于100目時(shí)，隨著粒度的增加異黃酮提取率下降。這說(shuō)明，在一定粒度范圍內(nèi)，隨粒度的增加黃酮的溶解性增強(qiáng)，但粒度過(guò)細(xì)，會(huì)使黃酮在樣品顆粒表面的吸附增加，從而降低其在溶劑中的溶解性。因而選擇100目為最適粒度。

2.1.3 液料比對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，黑豆異黃酮提取率也隨著增加，液料比為45∶1(m L/g)時(shí)，異黃酮的提取率達(dá)到最大值;之后隨著液料比的增大，異黃酮提取率隨之下降，原因是液料比過(guò)大使溶劑的量過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的過(guò)多溶出，從而影響異黃酮溶解。因而最適液料比選擇為45∶1(m L/g)。

圖2 顆粒粒度對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of particle sizes on yield of isoflavone from black soybean

圖3 液料比對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratios on yield of isoflavone from black soybean

2.1.4 提取溫度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖4可以看出，隨著提取溫度的升高，黑豆異黃酮提取率也隨之升高。溫度為50℃時(shí)異黃酮提取率最大，溫度大于50℃時(shí)，提取率反而下降。可能是由于高溫會(huì)破壞異黃酮的結(jié)構(gòu)，影響異黃酮的提取效果。因此選擇50℃為最適提取溫度。

圖4 溫度對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖5可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的增加，黑豆異黃酮的提取率會(huì)隨之增加。增加提取時(shí)間會(huì)使物質(zhì)能更加充分的溶解，使顆粒中物質(zhì)溶解完全，但在50m in后提取率的增加相對(duì)較小，只會(huì)增加提取的成本，從經(jīng)濟(jì)以及操作方面考慮，因此選擇50m in為最適提取時(shí)間。

圖5 時(shí)間對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.5 Effect of time on yield of isoflavone from black soybean

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖6可以看出，隨著提取次數(shù)的增加異黃酮的提取率也增加。提取次數(shù)會(huì)使顆粒中物質(zhì)溶解更為完全，提取更為充分，從經(jīng)濟(jì)與操作方面考慮。因此選擇2次為最適提取次數(shù)。

圖6 提取次數(shù)對(duì)黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction times on yield of isoflavone from black soybean

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取影響黑豆異黃酮提取率的主要因素(液料比、時(shí)間、溫度)進(jìn)行三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)，利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化的黑豆異黃酮提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，利用軟件Design Expert進(jìn)行液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素對(duì)黑豆異黃酮提取率影響的回歸分析，建立三元二次響應(yīng)面回歸方程:

從表3可知，回歸方程極顯著，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值具有高度的相關(guān)性(R2=0.9841)。擬合程度＞90%，說(shuō)明模型能夠反映響應(yīng)值的變化，說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法可靠，使用該方程模擬真實(shí)的三因素三水平的分析可行。失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起;由表3中可知，液料比、提取溫度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)黑豆異黃酮的提取率的影響極顯著或顯著;提取時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)黑豆異黃酮的提取率的影響極顯著，而一次項(xiàng)不顯著。表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。因此，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝條件。而各因素的交互作用對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響不顯著。

表2 三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Three factors and three levels of central composite experiment scheme and results

2.2.2 黑豆異黃酮提取工藝響應(yīng)面分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面反映了當(dāng)液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素的任意變量取零點(diǎn)水平的時(shí)候，其它兩個(gè)因素的交互作用對(duì)黑豆異黃酮提取率的影響情況。曲面陡表明該因素對(duì)提取率的影響顯著，曲面平緩表明該因素對(duì)提取率的影響不顯著;等高線的形狀反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表明交互作用強(qiáng)，影響顯著，圓形則相反;等高線密集表明對(duì)提取率影響較大，稀疏表明影響較小。

2.2.2.1 液料比與提取溫度的交互作用 從圖7可看出，液料比的曲面較陡，溫度的曲面較平緩，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響顯著，提取溫度的影響不顯著;圖7中等高線沿液料比軸向較溫度軸向密集，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響比溫度大;等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)黃酮提取率的影響不顯著。

圖7 液料比與提取溫度的交互作用對(duì)提取率的影響Fig.7 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.2.2.2 液料比與提取時(shí)間的交互作用 從圖8可看出，液料比的曲面較陡，提取時(shí)間的曲面較平緩，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響顯著，提取時(shí)間的影響不顯著;圖8中等高線沿液料比軸向較時(shí)間軸向密集，說(shuō)明液料比對(duì)異黃酮提取率的影響比時(shí)間大;等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)異黃酮提取率的影響不顯著。

2.2.2.3 提取溫度與提取時(shí)間的交互作用 從圖9中可看出，提取溫度和提取時(shí)間的曲面都比較平緩，說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)異黃酮提取率的影響均不顯著;圖9中等高線沿溫度軸向較時(shí)間軸向密集，說(shuō)明溫度對(duì)異黃酮提取率影響比時(shí)間大;等高線為圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較弱，對(duì)黃酮提取率的影響不顯著。

圖8 液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響Fig.8 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

圖9 提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響Fig.9 Interaction effect of the extraction temperature and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

2.3 黑豆異黃酮最佳提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜上所述，在選取的各因素范圍內(nèi)，影響黑豆異黃酮提取效果的因素由強(qiáng)到弱依次為液料比、溫度、提取時(shí)間。根據(jù)回歸模型通過(guò)Design-Expert軟件分析得出，以60%乙醇為提取劑、顆粒粒度100目、連續(xù)提取2次條件下，超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳條件為液料比 45.74∶1(m L/g)、提取時(shí)間50.86min、溫度為52.01℃，黑豆異黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為1.891%?？紤]到實(shí)際情況，確定最佳提取工藝條件為:液料比46∶1(m L/g)、溫度52℃、提取時(shí)間51m in。在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際平均值為1.883%，與預(yù)測(cè)值偏差較小，說(shuō)明該回歸方程與實(shí)際情況擬合較好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說(shuō)明響應(yīng)面法適用于對(duì)超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.4 不同產(chǎn)地的黑豆異黃酮的測(cè)定

超聲波提取法:準(zhǔn)確稱取粒度為100目的樣品一定量，按液料比46∶1加入60%乙醇，室溫浸泡2h，52℃超聲處理51m in，連續(xù)處理2次。

由表4可以看出，在最佳提取條件下對(duì)不同產(chǎn)地的黑豆異黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示產(chǎn)地為吉林的黑豆異黃酮含量最高。

表4 不同產(chǎn)地黑豆異黃酮的測(cè)定Table4 Determination of isoflavone from black soybean in different producing areas

3 結(jié)論

以產(chǎn)于吉林的黑豆為材料，采用超聲波法對(duì)黑豆異黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法對(duì)黑豆異黃酮提取的工藝條件建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，對(duì)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)誤差小，模型擬合度高，考慮到實(shí)際情況，最佳的提取工藝條件可校正為在乙醇濃度60%、粒度100目、液料比46∶1(m L/g)、溫度52℃、提取時(shí)間51m in、提取2次，此工藝條件下黑豆異黃酮的提取率為1.883%，與預(yù)測(cè)值1.891%相差較小。此實(shí)驗(yàn)表明超聲波提取黑豆異黃酮比傳統(tǒng)的振蕩提取法要更經(jīng)濟(jì)、快捷、高效，在異黃酮提取應(yīng)用范圍內(nèi)越來(lái)越受到重視。同時(shí)根據(jù)最佳提取工藝測(cè)定了其他四個(gè)產(chǎn)地的黑豆異黃酮含量，結(jié)果表明，產(chǎn)于吉林的黑豆異黃酮含量最高，產(chǎn)于山西的黑豆異黃酮含量最低。

［1］張晨，楊曉泉，唐傳核.大豆異黃酮的熱水提取及其純化工藝的優(yōu)化［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26(5):77-80.

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