馬尾松松針總黃酮純化工藝的研究

邱佳妹，周愛存

(浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江杭州311300)

馬尾松松針為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)馬尾松(Pinusmassoniana Lamb.)的針葉，別名豬鬃松毛、松毛、山松須，廣泛分布于江蘇、浙江、安徽、河南及長(zhǎng)江中下游各省山地。松針用藥歷史悠久，最早記載于《名醫(yī)別錄》上品卷一“松葉，其味苦溫，主治風(fēng)濕痹氣，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑，延年?！爆F(xiàn)代研究表明，松針具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌等作用，并廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕病、心腦血管疾病、糖尿病、肥胖病等癥［1-3］。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)松針的化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，從中分離得到多種黃酮及其苷類［4］、木脂素類［5-8］等。有研究表明，松針中黃酮具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂等多種生理功能［9-10］。當(dāng)前，有關(guān)松針的研究主要集中在提取工藝以及粗提物藥理活性等方面［11-13］，而關(guān)于松針中總黃酮的純化工藝未見有報(bào)道。本研究旨在尋找具有一定選擇性、吸附容量大且易于解吸附的樹脂，為分離純化松針總黃酮，充分開發(fā)利用松針資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾松松針 2011年8月采自浙江湖州和孚鎮(zhèn)，40℃下烘干，剪成1～1.5cm小段裝袋備用;蘆丁對(duì)照品 中國(guó)食品藥品檢定研究院;Amberlite XAD-7HP樹脂 美國(guó)羅門哈斯公司;AB-8、HPD-600、HPD-200A樹脂 滄州寶恩化工有限公司;DM130樹脂 杭州爭(zhēng)光樹脂有限公司;Diaion HP-20樹脂日本三菱公司;聚酰胺(30～60目) 華東醫(yī)藥股份有限公司;乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁 華東醫(yī)藥股份有限公司，均為分析純。

玻璃層析柱(Φ25×500mm) 華東醫(yī)藥股份有限公司;UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;SHZ-95型循環(huán)水多用真空泵 河南予華儀器廠;FA2004A電子天平(萬分之一) 河南兄弟儀器公司;101-A型電熱恒溫干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)用7種樹脂先用95%乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，傾去乙醇以及漂浮物后濕法裝柱，用95%的乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加等體積的水不變白色渾濁為止;用蒸餾水以同樣流速洗盡乙醇，然后用2BV的5%鹽酸溶液以4～6BV/h流速通過樹脂層，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性;再用2BV的4%氫氧化鈉溶液以4～6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4h，最后用水以同樣流速洗至出水pH中性。將預(yù)處理后的樹脂過濾并用濾紙吸干表面水分，于室溫(25℃)下放置24h，即得干樹脂。

1.2.2 松針黃酮提取液的制備 稱取松針50.0g置于圓底燒瓶中，以70%乙醇為提取劑，調(diào)節(jié)提取溶劑pH至10，回流提取2次，每次1h，料液比分別為1∶10、1∶8，過濾，合并兩次提取液，于4℃冰箱中靜置12h。減壓抽濾靜置后的松針提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70℃下減壓回收乙醇至無醇味，用蒸餾水定容至500m L，并用濃HCl調(diào)pH3，即為實(shí)驗(yàn)用TFPMNs提取液。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 精密稱取干燥恒重的蘆丁對(duì)照品12.8mg，加蒸餾水溶解并定容至100m L的量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度0.128g/L的對(duì)照品溶液。分別精密量取上述蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L于25m L容量瓶中，各用蒸餾水補(bǔ)充至6.0m L，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0m L，搖勻，放置6m in后再各加入10%硝酸鋁1.0m L，搖勻。6m in后再加入1mol/L的氫氧化鈉溶液10m L，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置。10min后于510nm處測(cè)吸光度，試劑為空白參比，以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度之間的回歸方程:C= 0.0819A+0.0008，R2=0.9995，式中A為吸光度，C為總黃酮濃度(mg/m L)。

液體樣品的測(cè)定:先把液體樣品定容至適當(dāng)體積，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0m L，置于10m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。再?gòu)闹腥?.0m L于25m L容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、1mol/L的氫氧化鈉，再用蒸餾水定容至刻度，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算總黃酮濃度;固體樣品的測(cè)定:精密稱取樣品粉末30mg，用蒸餾水定容在50m L容量瓶中，再?gòu)闹腥?.0m L于25m L容量瓶中，按上述方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮濃度，按式(1)計(jì)算固體中總黃酮純度。

式中:P為固體中總黃酮純度(%);Cs為液體中黃酮的濃度(mg/m L);Vs為液體體積(m L);Ms為固體的質(zhì)量。

1.2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 樹脂飽和吸附量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的6種干樹脂、聚酰胺各2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入松針總黃酮提取液20.0m L，密封后室溫下振蕩(180 r/m in)12h至吸附平衡，吸取上層液體測(cè)定總黃酮濃度。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，取三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，并按式2、式3計(jì)算飽和吸附量Q和吸附率A:

式中:Q為吸附量(mg/g干樹脂);C0為吸附前溶液濃度(mg/m L);Cr為吸附后溶液濃度(mg/m L); V為溶液體積(m L);W為干樹脂重量(g)。

1.2.4.2 脫附率的測(cè)定 將上述吸附飽和后的樹脂過濾，吸干樹脂表面的水分，精密加入80%乙醇10m L，室溫振蕩(180 r/m in)12h，使其達(dá)到飽和脫附，濾過后濾液定容，測(cè)此時(shí)溶液中總黃酮的濃度。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，取三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，按照式4、式5計(jì)算脫附率和回收率:

式中:D為脫附率，R為回收率，CD為脫附液濃度(mg/m L)，C0為樣品中總黃酮濃度(mg/m L)，VD為脫附液體積(m L)，V0為樣品提取液的體積(m L)，W為干樹脂重量(g)，Q為吸附量(mg/g干樹脂)。

1.2.4.3 上柱液濃度的選擇 準(zhǔn)確稱取靜態(tài)實(shí)驗(yàn)所篩選的干樹脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入一定體積的不同濃度的松針總黃酮提取液，其余操作同1.2.4.1。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，取三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，比較提取液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響。

1.2.4.4 上柱液pH的選擇 準(zhǔn)確稱取靜態(tài)實(shí)驗(yàn)所篩選的干樹脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，精密加入不同 pH的松針總黃酮提取液20m L，其余操作同1.2.4.1。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，取三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，比較提取液pH對(duì)樹脂吸附性能的影響。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn) 稱取靜態(tài)實(shí)驗(yàn)所篩選的干樹脂100mg，經(jīng)預(yù)處理后濕法裝入Φ25×500mm的層析柱中，用蒸餾水洗滌平衡。將TFPMNs提取液稀釋并將pH調(diào)至最佳范圍，得上柱液的總黃酮質(zhì)量濃度為1.1mg/m L。然后以不同流速上樣，分段收集上樣流出液，通過測(cè)定流出液中總黃酮含量考察上柱液流速等因素對(duì)樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。

對(duì)已吸附樣品的樹脂進(jìn)行脫附實(shí)驗(yàn)，用2BV蒸餾水洗至流出液澄清，用不同濃度的乙醇以一定流速洗脫，收集洗脫液，通過測(cè)定流出液中總黃酮含量考察乙醇的濃度、流速等因素對(duì)樹脂脫附性能的影響，確定最佳脫附工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 樹脂的初步篩選結(jié)果 7種樹脂對(duì)松針總黃酮提取液的吸附-脫附性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可以看出，Amberlite XAD-7HP和聚酰胺對(duì)松針總黃酮的靜態(tài)飽和吸附量均較高，可以達(dá)到44.0mg/g以上，可以用于松針總黃酮的吸附。但是，兩種樹脂的脫附率差別較大，Amberlite XAD-7HP樹脂的脫附率為83.7%，明顯高于聚酰胺的脫附率28.1%，表現(xiàn)出最佳的綜合性能。因而，優(yōu)選Amberlite XAD-7HP分離純化TFPMNs。

表1 7種樹脂對(duì)TFPMNs靜態(tài)吸附與解吸性能(n=3)Table1 Static adsorption and desorption properties of7 resins for TFPMNs(n=3)

2.1.2 濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響 總黃酮樣品液的濃度對(duì)樹脂Amberlite XAD-7HP吸附性能的影響結(jié)果如表2所示。由表2可知，當(dāng)松針總黃酮質(zhì)量濃度在1.36～10.84mg/m L區(qū)間內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，樹脂對(duì)黃酮的飽和吸附量增大，但是當(dāng)濃度達(dá)到21.68mg/m L時(shí)，樹脂的飽和吸附量不增反而微降，可能與溶液濃度過高，粘度過大，影響吸附有關(guān)。綜合考慮，選取10.8mg/m L的黃酮提取液作為最適宜上柱液。

表2 濃度對(duì)XAD-7HP樹脂吸附性能的影響(n=3)Table2 Effect of sample concentration on adsorption property of Resin XAD-7HP(n=3)

2.1.3 上柱液pH對(duì)樹脂吸附性能的影響 上樣液的pH對(duì)樹脂Amberlite XAD-7HP吸附性能的影響結(jié)果如表3所示。由表3可知，隨著松針總黃酮提取液pH的提高，樹脂對(duì)總黃酮的飽和吸附量明顯下降。這主要是由于隨著pH的增大，浸提液中的總黃酮以鹽的形式存在而不易被樹脂所吸附，因此應(yīng)盡可能的調(diào)低pH。但是，考慮到提取液的pH太低，容易造成黃酮苷類成分水解，故本實(shí)驗(yàn)選取上柱液的pH為3.0為宜。

2.2 大孔樹脂對(duì)松針總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 上樣流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 在同一實(shí)驗(yàn)條件下考察不同上樣流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1得知，上樣流速為1～2BV/h時(shí)，隨著上樣流速的增大，吸附量變化不大，而當(dāng)流速在2～4BV/h時(shí)，樹脂吸附量隨著流速的增大下降顯著。這可能是由于流速過快，被吸附物質(zhì)分子尚未擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面就已泄露。1BV/h時(shí)吸附量雖然略高于2BV/h的吸附量，但考慮到1BV/h的上樣速率太慢，上樣耗時(shí)太長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)選用2BV/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知，一次處理松針總黃酮提取液的體積可達(dá)4BV。

表3 pH對(duì)樹脂吸附性能的影響(n=3)Table3 Effect of pH value on adsorption property of Resin XAD-7HP(n=3)

圖1 上樣流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響Fig.1 Effect of flow rate on adsorption property of Resin XAD-7HP

2.2.2 洗脫液濃度對(duì)脫附性能的影響 在同一實(shí)驗(yàn)條件下考察不同濃度的乙醇洗脫液對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸附性能的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2得知，總黃酮脫附率隨著乙醇濃度的增大而增大，80%的乙醇的脫附率可達(dá)94.08%，95%乙醇的脫附率為94.69%，兩者相差不大，因此選擇80%的乙醇作為松針總黃酮的脫附劑。

2.2.3 洗脫液流速對(duì)脫附性能的影響 在同一實(shí)驗(yàn)條件下考察洗脫液的不同流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸附性能的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，脫附劑流速越快，脫附性能越差，達(dá)到基本脫附完全所需的脫附劑也就越多。從節(jié)省脫附劑的角度考慮應(yīng)盡可能采用低流速洗脫。但洗脫流速太慢，又會(huì)使工作周期延長(zhǎng)，因此，綜合考慮各因素，選擇1BV/h的洗脫流速為宜。本實(shí)驗(yàn)用2BV的80%乙醇以1BV/h的流速洗脫，脫附率可達(dá)93%以上。

圖2 洗脫液濃度對(duì)脫附性能的影響Fig.2 Effect of ethanol aqueous solution concentration on desorption propertyof Resin XAD-7HP

圖3 洗脫液流速對(duì)脫附性能的影響Fig.3 Effect of eluent flow rate on desorption property of Resin XAD-7HP

2.3 工藝驗(yàn)證

量取上述馬尾松松針提取液適量，按上述優(yōu)化后的吸附條件和解析條件平行進(jìn)行三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，精制后的總黃酮液體經(jīng)減壓濃縮，50℃烘箱中烘干后可得棕黃色的黃酮粉末。以總黃酮回收率及粉末中總黃酮純度為指標(biāo)，考察工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，粉末中總黃酮的純度提高到65.9%±1.3%，總黃酮回收率可以達(dá)80.2%±2.6%，工藝具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

大孔吸附樹脂是一類新型高分子聚合物，在分離化學(xué)成分時(shí)具有穩(wěn)定性高、不受無機(jī)物存在的影響、再生簡(jiǎn)便、環(huán)保節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于單味中藥或復(fù)方中有效部位群以及單體成分的富集純化中。近年來不斷有文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道大孔吸附樹脂在分離純化黃酮類成分的過程中顯示出卓越的性能。本文選取6種不同性質(zhì)(包括非極性、弱極性、中極性以及極性)的大孔吸附樹脂作為備選樹脂用于TFPMNs的分離純化。此外，亦有文獻(xiàn)［16］報(bào)道聚酰胺分離具有酚羥基的黃酮類成分也收到了良好的效果，因此本文也將聚酰胺列為備選樹脂之一進(jìn)行篩選。以吸附率和解析率為指標(biāo)，靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Amberlite XAD-7HP對(duì)于TFPMNs具有良好的吸附和解析性能，可用于松針總黃酮的分離純化。聚酰胺對(duì)TFPMNs雖然也具有較大的吸附容量，但是由于解析率低而予以舍棄。

在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，Amberlite XAD-7HP在室溫條件下分離純化TFPMNs的最佳工藝參數(shù)為:上柱液總黃酮濃度為11mg/m L左右，上柱液pH3，上柱速度2BV/h，溶液處理量4BV/次;脫附劑為80%乙醇，脫附劑的流速 1BV/h，脫附劑用量 2BV。Amberlite XAD-7HP在該條件下對(duì)TFPMNs進(jìn)行純化，總黃酮純度達(dá)65.9%±1.3%，總黃酮回收率可達(dá)80.2%± 2.6%，顯示出良好的分離純化性能，且工藝穩(wěn)定性良好，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景。

本文研究的TFPMNs的純化工藝可為開發(fā)利用馬尾松松針的資源，提高松針產(chǎn)品附加值提供參考依據(jù)。此外，更高純度的TFPMNs的分離純化工藝尚需進(jìn)一步的研究。

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