響應(yīng)面法優(yōu)化紅雪茶中類(lèi)胡蘿卜素的提取工藝

楊青松，趙 艷，王 瑩，熊 勇，鄧芳軼

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500; 2.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，云南昆明650201; 4.云南省食品藥品檢驗(yàn)所化學(xué)室，云南昆明650011)

紅雪茶為地衣類(lèi)梅衣科(Parmeliaceae)金絲屬(Lethariella(Mot.)Krog.)2種不同地衣的統(tǒng)稱(chēng)，即金絲刷(L.cladoniioides)和金絲帶(L.zahlbruckneri)［1-2］。紅雪茶由于其地衣體為橘紅色至土紅色，開(kāi)水沖泡后色澤紅亮，猶如紅葡萄酒色，故在滇西北又稱(chēng)為鹿心雪茶?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紅雪茶具有清熱、抗炎、抗疲勞、抗輻射等作用［3-6］，具有鎮(zhèn)靜、消炎、止痛的功能［7］。據(jù)考證，少數(shù)民族，尤其是藏族將其作為茶飲具有悠久的歷史［1］，是一種天然、無(wú)污染、無(wú)毒副作用的野生飲品，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。植物源天然色素由于其色調(diào)自然、安全性高，同時(shí)大多數(shù)兼具營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，目前已逐漸替代人工合成色素［8-9］。對(duì)天然色素的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用成為行業(yè)熱點(diǎn)，而類(lèi)胡蘿卜素以其特殊生理功能和藥理功能一直是研究的熱點(diǎn)［10-11］。紅雪茶色素是一種天然食用色素，可用于食品，醫(yī)藥等行業(yè)中［12］。為充分利用這一資源，本文基于響應(yīng)面分析法，建立合適的BBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)丙酮提取紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素工藝在料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素上進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得其最佳提取工藝，為日后紅雪茶深加工等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅雪茶 2011年9月購(gòu)自云南省香格里拉縣山原土特產(chǎn)品經(jīng)銷(xiāo)店;丙酮 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自行制備。

FA1204B電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DFT-100手提式小型植物試樣粉碎機(jī) 北京科思佳科技有限責(zé)任公司;1650F紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品類(lèi)胡蘿卜素的提取 使用小型植物試樣粉碎機(jī)粉碎樣品，過(guò)100目篩，用丙酮浸提，過(guò)濾后，濾液濃縮，獲得類(lèi)胡蘿卜素提取液。

1.2.2 樣品類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定 浸提液過(guò)濾后，以丙酮為參比液，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)445nm，進(jìn)行比色法測(cè)定吸光值。

依照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水果、蔬菜汁類(lèi)胡蘿卜素全量的測(cè)定GB12291-90》計(jì)算提取液類(lèi)胡蘿卜素含量:

其中:A為提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值; 20為換算系數(shù)。

再根據(jù)式(1)以式(2)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素的實(shí)際含量:

其中:V為提取液樣品的體積(m L);F為提取液樣品在測(cè)定吸光值時(shí)的稀釋倍數(shù);M為紅雪茶樣品干粉質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取料液比(g/m L)、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)3個(gè)影響因素，考察這3個(gè)因素對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用 Design-Expert7.0軟件中的中心組合實(shí)驗(yàn)(Box-Behnken Design，BBD)原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)方案。選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，以紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取液的吸光值為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化其提取工藝條件。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平，見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素得率的影響 稱(chēng)取紅雪茶粉1.00g，分別設(shè)定料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7(g/m L)，在30℃條件下提取30min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface analysis

圖1 料液比對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction of carotenoids

由圖1可知，隨著液體比例的增加，類(lèi)胡蘿卜素的提取量先小幅度上升，當(dāng)料液比到達(dá)1∶3時(shí)，提取量達(dá)到最大。但隨液體比例持續(xù)增加，類(lèi)胡蘿卜素的提取量逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此選擇料液比1∶2、1∶3、1∶4作為紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取的響應(yīng)面分析料液比3水平。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素得率的影響

稱(chēng)取紅雪茶粉1.00g，提取時(shí)間分別設(shè)定為10、20、30、40、50、60m in，在料液比1∶3(g/m L)、溫度30℃條件下浸提，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of carotenoids

由圖2可知，提取時(shí)間10～20m in，類(lèi)胡蘿卜素的提取量變化不明顯;當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30m in時(shí)，提取量明顯增加，并達(dá)到最大值。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，類(lèi)胡蘿卜素的提取量逐漸降低，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，丙酮揮發(fā)越明顯。因此，選擇20、30、40m in作為類(lèi)胡蘿卜素的響應(yīng)面分析提取時(shí)間3水平。

2.1.3 提取溫度對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素得率的影響 稱(chēng)取紅雪茶粉1.00g，提取溫度分別設(shè)為25、35、45、55、65、75℃，在料液比1∶3(g/m L)條件下浸提30m in，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis for regression model

圖3 提取溫度對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of carotenoids

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，類(lèi)胡蘿卜素的提取量有明顯的增加，當(dāng)溫度到達(dá)55℃時(shí)，提取量最大。提取溫度繼續(xù)增加，類(lèi)胡蘿卜素的提取量有小幅度的降低，這可能是浸提溫度過(guò)高，導(dǎo)致溶劑揮發(fā)損失所致。因此，選擇45、55、65℃作為類(lèi)胡蘿卜素提取的響應(yīng)面分析溫度3水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

運(yùn)用Design expert7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

以紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取液的吸光值為響應(yīng)值，得到紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素對(duì)自變量X1(料液比)、X2(提取溫度)、X3(提取時(shí)間)的回歸方程:

表3中模型項(xiàng)p值為0.0002，該值小于0.01，說(shuō)明該模型回歸極顯著，可用于紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9664與決定系數(shù)為R=0.9233相差不大，表明回歸方程的擬合度好，失擬小，可用該回歸方程優(yōu)化紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素的提取工藝。同時(shí)表3中的 p值表明，方程中X1X2、X2X3、X、X對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取液的吸光值有極顯著影響。失擬項(xiàng)p值為0.2776，說(shuō)明無(wú)顯著性影響，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，模型適當(dāng)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面直觀(guān)分析 根據(jù)回歸方程，獲得料液比、提取溫度和提取時(shí)間兩兩相互作用對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface and contour plots of cross-interaction between each two factors

圖4a中響應(yīng)面的坡度很陡，可以得出料液比和提取溫度的交互影響對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的提取有顯著影響;溫度軸的等高線(xiàn)變化密集，料液比軸的等高線(xiàn)變化稀疏，所以料液比對(duì)響應(yīng)值峰值的影響較提取溫度大。圖4b中響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出提取時(shí)間和料液比的交互影響對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過(guò)等高線(xiàn)的疏密可以判斷在交互影響中料液比對(duì)響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。圖4c中響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出提取溫度和提取時(shí)間的交互影響對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取的影響不夠顯著，通過(guò)等高線(xiàn)的疏密可以判斷在交互影響中提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。故對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取量的影響大小順序?yàn)榱弦罕?X1)＞提取溫度(X2)＞提取時(shí)間(X3)，其中料液比的影響極顯著。

通過(guò)Design-Expert 7.0軟件分析，可以獲得紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素的最佳條件是在料液比為1∶3.07，溫度51.45℃，提取時(shí)間20.00min時(shí)，紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取量的預(yù)測(cè)吸光值為0.3794，理論類(lèi)胡蘿卜素提取量為23.295μg/g。采用最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得類(lèi)胡蘿卜素提取條件為料液比1∶3，提取溫度52℃，提取時(shí)間20m in，紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取量的吸光值平均為 0.3682，類(lèi)胡蘿卜素提取量達(dá)到22.092μg/g，實(shí)際值與理論值的相對(duì)誤差較小，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化后得到的紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取條件準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

類(lèi)胡蘿卜素在自然界中廣泛存在，具有特殊的生理功能和藥理功能，對(duì)人類(lèi)的健康非常重要。但由于人類(lèi)自身無(wú)法合成類(lèi)胡蘿卜素，所以類(lèi)胡蘿卜素的制備顯得很重要。目前制備天然的類(lèi)胡蘿卜素常用的方法有:有機(jī)溶劑提取法、酶反應(yīng)法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等［13］。其中后4種提取法都極大的提高了類(lèi)胡蘿卜素提取率［14-17］，如張衛(wèi)強(qiáng)等［14］應(yīng)用微波輻射萃取番茄紅素，在最佳的工藝條件下，色素提取率為97.56%。熊犍等［15］采用超聲輻射提取玉米類(lèi)胡蘿卜素，得到的類(lèi)胡蘿卜素的濃度是無(wú)超聲輻射時(shí)的16.25倍。但酶反應(yīng)法和超臨界流體萃取法儀器裝置復(fù)雜，不利于推廣應(yīng)用。而微波輔助提取法和超聲波輔助提取法則是以有機(jī)溶劑提取法為基礎(chǔ)的。因此對(duì)常規(guī)有機(jī)溶劑提取法工藝優(yōu)化是提高類(lèi)胡蘿卜素提取率的基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，基于常規(guī)有機(jī)溶劑提取法對(duì)紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后得到的紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素提取最佳工藝條件為:料液比1∶3(g/m L)、提取溫度52℃、提取時(shí)間20min，在該條件下類(lèi)胡蘿卜素提取液的吸光值為0.3682，實(shí)際獲取紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素22.092μg/g，與預(yù)測(cè)值接近。該實(shí)驗(yàn)獲得的優(yōu)化提取條件，能有效提高紅雪茶類(lèi)胡蘿卜素的提取量，為今后的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論參考。

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