樟芝固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Antroquinonol及萃取Antroquinonl的研究

喻學淳，夏永軍，張 歡，許贛榮，張薄博

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

樟芝(Antrodia Camphorata)，又名牛樟芝、牛樟菇、紅樟菇等，有“靈芝之王”、“森林紅寶石”之稱。野生樟芝只生長在臺灣本土的牛樟樹(Cinnamomum kanehirae)上，通常腐生于上百年的樹干空洞內(nèi)，野生樟芝子實體具有濃郁的樟香氣味［1］。樟芝子實體作為傳統(tǒng)藥物，被臺灣土著居民用作治療疾病的良藥。近年來，眾多研究表明，已確定樟芝產(chǎn)品具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、解毒、抗炎等功效［2］。樟芝子實體具有的這些功效與其含有的眾多活性成分有關(guān)，其主要活性成分是多種三萜類化合物［3-6］、活性多糖、馬來酸和琥珀酸衍生物、泛醌類化合物等［7-9］。Antroquinonol屬于泛醌類化合物，具有顯著的抗癌活性，并且，它對于肝癌細胞與正常細胞有選擇性［10］，目前已進入FDA二期臨床實驗，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。由于牛樟樹是臺灣特有的珍稀樹種，野生樟芝子實體的產(chǎn)量極度匱乏，因此市售樟芝主要來源于人工培養(yǎng)，目前的人工培養(yǎng)方式主要有椴木培養(yǎng)法、固態(tài)培養(yǎng)法和液態(tài)培養(yǎng)法。椴木培養(yǎng)法仍然受到牛樟樹稀有性的限制，液態(tài)培養(yǎng)法得到的樟芝產(chǎn)品中的產(chǎn)物活性成分與野生樟芝差別極大，幾乎不含Antroquinonol，固態(tài)培養(yǎng)可模擬樟芝野生環(huán)境且不受牛樟樹稀有性的限制，其代謝產(chǎn)物種類更接近于樟芝子實體。但目前國內(nèi)外對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)樟芝的研究比較少，對Antroquinonol的研究都集中在其藥理活性上面，除了Lee等［9］首次鑒定出Antroquinonol的研究中，提到過用固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)樟芝并用正己烷的方法萃取Antroquinonol以外，專門針對Antroquinonol的固態(tài)發(fā)酵工藝及提取方法的研究幾乎沒有。本文通過培養(yǎng)基的優(yōu)化達到提高樟芝固態(tài)發(fā)酵中Antroquinonol含量的目的，并通過理論計算、模擬實驗，確定了合適的樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol合適的萃取工藝條件。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化實驗設(shè)計Table1 The experimental design ofmedium optimization

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟芝菌 上海福茂食品有限公司提供;種子液培養(yǎng)基 種子液培養(yǎng)基成分如文獻［11］所示;原固態(tài)培養(yǎng)基(1L三角瓶) 谷物原料100g，NH4Cl 0.04g，K2HPO40.025g，MgSO40.025g，初始含水量 50% (g水/g干基)，接種量 30%(m L/g干基)，28℃培養(yǎng);萃取原料 實驗室發(fā)酵產(chǎn)品;乙醇 體積分數(shù)為95%，國產(chǎn);乙腈 色譜級，德國Meker公司等。

DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;PL602-S電子天平 梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;高效液相色譜儀 配有SPD-10AVP檢測器，日本島津公司; Sepax Amethyst C18柱(4.6mm×250mm) 美國賽分公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法如文獻［11］所示。

1.2.2 分析檢測方法 樟芝產(chǎn)品中的Antroquinonol的HPLC分析方法如文獻［12］所示。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化方法 樟芝固態(tài)發(fā)酵中各因素的優(yōu)化實驗設(shè)計如表1所示。其中，初始含水量包括接種種子液含水、大米含水以及添加水。按式1計算:

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中 Antroquinonol的萃取方法 本實驗室最初采用簡單接觸流程法，該方法各項參數(shù)為:體積分數(shù)為95%的乙醇與樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的比例為60∶1，50℃水浴振蕩萃取1.5h。然而該方法存在著三個方面的缺點:溶劑消耗量大;萃取時間長;產(chǎn)品中的Antroquinonol萃取不完全。因此，本次實驗中考慮采用多級逆流萃取代替簡單接觸流程法。通過實驗經(jīng)驗以及相關(guān)公式的計算［13-14］，設(shè)計逆流萃取的萃取條件為:乙醇與萃取物料比例為10∶1(v/w)，在水浴溫度50℃，振蕩萃取1h條件下進行三級逆流萃取。預(yù)期Antroquinonol的殘留率小于1%。實驗建立的三級逆流萃取過程如圖1所示。根據(jù)浸提模型［14］可知，從萃取級數(shù)三中得到的第三級萃取 液中 Antroquinonol的 含量 和 殘 渣 中Antroquinonol含量的相同。所以，通過標準曲線將第三級萃取液中的Antroquinonl含量換算成相應(yīng)質(zhì)量固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol含量，此含量即為殘渣中的Antroquinonol含量，可用來計算Antroquinonol殘留率。Antroquinonol殘留率的計算公式如式(2)

數(shù)據(jù)430.196(mg/kg)表示樣品中Antroquinonol總含量。數(shù)據(jù)來源如下:在料液比1∶60(m/v)，50℃水浴振蕩1.5 h的單級萃取條件下，將一份樣品反復(fù)用新的萃取液萃取，直至萃取液中檢測不出Antroquinonol。通 過 計 算 求 各 萃 取 液 中 的Antroquinonol含量之和，并換算成相應(yīng)質(zhì)量固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol含量，既得樣品中Antroquinonol總含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化實驗

2.1.1 發(fā)酵基質(zhì)對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響 固態(tài)發(fā)酵中，一方面發(fā)酵基質(zhì)作為菌體生長的附著物，起著支撐發(fā)酵物的作用，影響發(fā)酵體系中的傳質(zhì)、傳熱;另一方面發(fā)酵基質(zhì)作為主要營養(yǎng)物質(zhì)，為發(fā)酵提供主要碳源及復(fù)雜的生長因子，影響著微生物的生長、代謝。因此，發(fā)酵基質(zhì)的選擇對樟芝固態(tài)發(fā)酵有著重要的影響。

如圖2所示，以5種谷物原料為發(fā)酵基質(zhì)進行樟芝固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵干基中Antroquinonol含量依次為:大米＞糯米＞小米＞高粱＞薏米仁。明顯，高粱和薏米仁不適合作為樟芝固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)。雖然小米適合用于樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)三萜類化合物［11］，但并不適合作為產(chǎn)Antroquinonol的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。糯米作為發(fā)酵基質(zhì)所得到的發(fā)酵干基中Antroquinonol含量不低，但由于其粘度較大，不利于接種操作。而當大米作為發(fā)酵基質(zhì)時，其發(fā)酵干基中Antroquinonol的含量最高，達到608.93mg/kg。并且大米來源廣泛，價格低廉，所以大米是樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的最佳發(fā)酵基質(zhì)。以下實驗均采用大米作為發(fā)酵基質(zhì)。

圖1 樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol的三級逆流萃取過程Fig.1 The three-stage countercurren extraction process of Antroquinonol in the solid-state fermentation products of A.camphorata

圖2 發(fā)酵基質(zhì)種類對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響Fig.2 The effect of fermented grain types on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.2 裝料量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響 樟芝固態(tài)發(fā)酵采用1L三角瓶作為發(fā)酵容器，由于發(fā)酵空間有限，發(fā)酵基質(zhì)的裝料量對固態(tài)發(fā)酵過程中的傳質(zhì)、傳熱有著重要的影響。如果發(fā)酵基質(zhì)裝料量過多，發(fā)酵培養(yǎng)基太厚，會導致傳熱困難，培養(yǎng)基中心溫度過高，且氧的傳質(zhì)也會受到阻礙，這些因素都不利于菌體的生長及代謝產(chǎn)物的合成。

如圖3所示，裝料量為 110g/L時，干基中Antroquinonol的含量最高，為635.31mg/kg。當裝料量增大到120g/L時，干基中Antroquinonol含量下降了 40.66%。當裝料量小于 110g/L時，干基中Antroquinonol含量基本上隨裝料量的增加而升高。說明裝料量過大或者過小都不利于Antroquinonol的合成。所以選擇110g/L作為發(fā)酵基質(zhì)的裝料量，以下實驗中裝料量均采用此標準。

2.1.3 初始含水量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中的含水量對基質(zhì)的物理特性有著重要的影響［15-16］。含水量過高，會使谷物基質(zhì)顆粒間的孔隙率減小，從而影響基質(zhì)的傳熱、傳質(zhì);含水量過低，會導致谷物基質(zhì)顆粒變硬、水活度降低，從而限制微生物的生長。

圖3 發(fā)酵基質(zhì)裝料量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響Fig.3 The effect of substrate capacity on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

如圖4所示，初始含水量為50%時，樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol含量最高，為544.16mg/kg。含水量高于或低于 50%時，樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol含量都會受到影響。特別是當含水量太高時，培養(yǎng)基粘度增大，種子液與基質(zhì)攪拌不均勻，不利于微生物在基質(zhì)中的生長。所以選擇初始含水量為50%進行固態(tài)發(fā)酵較為合適，后面的實驗均采用這一標準。在實驗過程中，隨著發(fā)酵的進行，樟芝菌絲體慢慢地包裹住谷物基質(zhì)顆粒，利用谷物基質(zhì)內(nèi)部的淀粉，使得發(fā)酵基質(zhì)的含水量逐漸升高。在發(fā)酵結(jié)束時，樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的含水量可達到70%左右。

圖4 初始含水量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響Fig.4 The effect of initialmoisture content on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.4 外加碳源(葡萄糖)對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響 由于固態(tài)發(fā)酵周期較長，前期很大一部分時間用于菌體的生長，而Antroquinonol是次級代謝產(chǎn)物，如果能縮短菌體生長時間，使發(fā)酵周期中更多的時間用于次級代謝產(chǎn)物的積累，就可以縮短發(fā)酵周期，提高Antroquinonol的產(chǎn)量。本次實驗考慮添加葡萄糖作為樟芝快速生長的碳源，促進樟芝菌的快速生長，縮短發(fā)酵周期。

如圖5所示，外加葡萄糖的濃度對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol的產(chǎn)量有明顯的影響。在葡萄糖添加量為 2.0g/L時，樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol的含量最高，達到650.46mg/kg，因此后續(xù)的實驗以2.0g葡萄糖/L為外加碳源添加標準。在發(fā)酵過程中觀察到，樟芝菌覆蓋包裹住谷物基質(zhì)顆粒的時間隨葡萄糖的添加而有所提前。

圖5 外加碳源(葡萄糖)對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響Fig.5 The effect of supplementary carbon source(glucose) on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.1.5 氮源含量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響 谷物基質(zhì)中以淀粉等碳源物質(zhì)為主，氮源含量很少，因此需要在谷物基質(zhì)中添加一定量的氮源，以保障菌體的正常生長。樟芝固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)三萜類物質(zhì)的實驗中，NH4Cl是最好的氮源［11］，但在樟芝固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Antroquinonol實驗中，大豆粉是最好的氮源。因此，本次實驗考察大豆粉添加量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響。

如圖6所示，氮源添加量從0g大豆粉/L增加到0.1g大豆粉/L，樟芝產(chǎn)品中Antroquinonl含量隨之增加。當添加量為0.3g大豆粉/L時，Antroquinnol含量達到最高，為696.83mg/kg。而繼續(xù)提高氮源添加量，Antroquinonol的含量反而有所下降。所以0.3g大豆粉/L是較為合適的氮源添加量。

圖6 氮源含量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的影響Fig.6 The effect of nitrogen content on Antroquinonol content by A.camphorata in solid-state fermentation

2.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中Antroquinonol的萃取實驗

為了從樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中得到更多的Antroquinonol，并為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考，本實驗考察了樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中Antroquinonol的萃取工藝。

三級逆流萃取系統(tǒng)建立后，萃取系統(tǒng)即進入平衡過程，第一次排出濾渣時，對萃取級數(shù)一、萃取級數(shù)二、萃取級數(shù)三各取一個樣，標記為取樣序列1;其后的每次萃取都同時對萃取級數(shù)一、萃取級數(shù)二、萃取級數(shù)三各取一個樣，取樣序列依次標記。取樣后微濾，用HPLC檢測Antroquinonol含量并進行分析，結(jié)果如表2所示。

表2 三級逆流萃取中各級Antroquinonol含量及殘留率Table2 The content and residual rate of Antroquinonol in each stage of the three-stage countercurren extraction process

在逆流萃取系統(tǒng)建立后的第一次取樣時，在取樣序列1的一級萃取液中積累了三份樣品中的Antroquinonol，所以取樣序列1的第一級萃取液中Antroquinonol含量最高，是取樣序列2的第一級萃取液中Antroquinonol含量的2.56倍。從取樣序列4開始，第一級萃取液中的 Antroquinonol含量在42～50mg/m L之間波動，這種小范圍的波動是三級萃取下基本達到平衡后的標志。且從取樣序列4開始，Antroquinonol的殘留率小于1%，達到預(yù)期要求。并且，如表3所示，三級逆流萃取的溶劑萃取能力是單級萃取的溶劑萃取能力的6～7倍，溶劑損失變化不大，Antroquinonol殘留率大大減小。因此，采用三級逆流萃取能大大提高萃取溶劑的萃取能力，極大地節(jié)約萃取溶劑的用量，這對于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用中經(jīng)濟成本的降低具有重大的意義。

表3 單級萃取與三級逆流萃取參數(shù)比較Table3 The comparison of parameters between single stage extraction and three-stage countercurren extraction processes

3 結(jié)論

經(jīng)實驗比較，確定優(yōu)化后的樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antroquinonol的固態(tài)培養(yǎng)基配方是:1L三角瓶中大米裝料量為110g，初始含水量為50%，外加碳源為2.0g葡萄糖，氮源添加量為 0.3g大豆粉。Antroquinonol含量從608.93mg/kg提高到696.83mg/kg，提高14.44%。

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，用體積分數(shù)為95%的乙醇作萃取劑(乙醇與萃取物料比例為10∶1，v/w)，以水浴溫度50℃，振蕩萃取1h為萃取條件進行三級逆流浸提，殘渣中的Antroquinonol殘留率小于1%。該法具有溶劑使用量少，萃取效率高的優(yōu)點。其溶劑萃取能力是原單級萃取的溶劑萃取能力的6～7倍，能極大地降低大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用中的經(jīng)濟成本。

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