高抗菌活性乳酸菌的篩選及菌種鑒定

■李東霞 龐會利 王雁萍 談重芳 倪奎奎 董湘熔 金慶生

（1.鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州 450052；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院作物與核技術(shù)利用研究所，浙江杭州 310021）

乳酸菌是一種廣泛分布于自然界而且普遍應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的益生菌。乳酸菌可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，包括有機酸，過氧化氫及細菌素等；其中細菌素是由微生物通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的蛋白類物質(zhì)，抑菌范圍不僅僅局限于同源的細菌，產(chǎn)生菌對其細菌素具有自身免疫性。細菌素與抗生素不同，一些抗生素殺死病原微生物的同時，還會破壞動物腸道正常菌群，導致菌群失調(diào)、抵抗力下降，疾病的發(fā)病率增加等不良情況。而乳酸菌產(chǎn)生的細菌素因其具有無毒性，無抗藥性，易被消化道中的蛋白酶降解，不易在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)等特性，已經(jīng)引起開發(fā)高效安全飼料添加劑科研人員的密切關(guān)注[1-5]。細菌素可防止飼料本身被沙門氏菌等致病菌的污染，防止致病菌對動物的危害，并且可限制帶菌動物排瀉物中病原微生物的傳播。我國農(nóng)業(yè)部第105號公布的允許使用的飼料級微生物添加劑共12種，植物乳桿菌是其中的一種；菌體本身與所產(chǎn)植物乳桿菌素在飼料中主要應(yīng)用于青貯飼料、微生物發(fā)酵飼料及飼料添加劑等方面[6-7]。盡管乳酸菌在飼料青貯中已有所應(yīng)用，但由于飼料種類繁多，分布區(qū)域環(huán)境條件差異較大，仍然需要廣泛篩選優(yōu)良乳酸菌，開發(fā)新的適合具體需求的高效飼料青貯用乳酸菌添加劑。分離篩選高抗菌活性的乳酸菌，不僅有利于飼料青貯，還可以應(yīng)用于食品、飼料的殺菌防腐和微生態(tài)制劑的研究開發(fā)。本實驗篩選出一株抑菌活性較強的乳酸菌，并對其生物學特性進行研究，旨在為這一菌株作為飼料青貯添加劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

乳酸菌菌株共121株，分離自玉米、水稻、蔬菜殘渣、豬糞、雞糞等樣品；指示菌有藤黃微球菌、大腸桿菌、沙門氏菌，均為實驗室保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、菌株DNA提取試劑盒、MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 高抗菌活性菌株的初篩

將保存于-80℃冰箱中的乳酸菌活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r/min離心5 min，取上清液用于高抗菌活性乳酸菌的篩選；采用牛津杯雙層平板法[8]測定其抑菌活性。

1.2.2 產(chǎn)細菌素菌株的復(fù)篩

乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生許多具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機酸、過氧化氫等，因此在篩選細菌素產(chǎn)生菌時需要排除這些因素的干擾，并初步確定其抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

①酸抑制作用的排除：選取對三種指示菌均有抑制作用的菌株，按上訴方法制備發(fā)酵上清液，測上清液的pH值，用2 mol/l NaOH和2 mol/l乳酸調(diào)發(fā)酵上清液pH值至5.0，并用乳酸調(diào)未接種的MRS液體培養(yǎng)基pH值至5.0作為對照；用牛津杯雙層平板法做抑菌實驗。

②過氧化氫酶作用的排除：選取酸排除后依然有抑菌作用的乳酸菌菌株制備發(fā)酵上清液，調(diào)pH值至7.0，按照過氧化氫酶終濃度為5.0 mg/ml加入到發(fā)酵液中，37℃水浴2 h，再將pH值調(diào)至5.0，檢測過氧化氫酶處理后發(fā)酵上清液的抑菌活性。

③蛋白酶解檢測：選取篩選出的乳酸菌制備發(fā)酵上清液，調(diào)發(fā)酵上清液到胰蛋白酶和蛋白酶K的最適作用pH值，按1.0 mg/ml加入胰蛋白酶和蛋白酶K，同上處理，檢測胰蛋白酶和蛋白酶K對乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

1.2.3 細菌素生物學特性初步鑒定

① 熱敏感性：將發(fā)酵上清液分別置60、80、100℃水浴鍋30 min和60 min，121℃滅菌鍋15 min；冷卻后進行抑菌實驗。

②pH敏感性：發(fā)酵上清液，用1 mol/l乳酸和1 mol/l NaOH調(diào)其pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37 ℃溫育2 h后，進行抑菌實驗。

1.2.4 產(chǎn)細菌素乳酸菌的鑒定

①菌株表型特征及生理生化實驗：觀察培養(yǎng)皿上菌落的形狀、顏色、大小等，用革蘭氏染色后觀察細胞的形態(tài)。生理生化實驗包括觀察不同溫度、pH值、鹽(NaCl)濃度條件下的生長狀況、過氧化氫酶實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗，碳源發(fā)酵實驗[9]。

②16S rRNA基因PCR產(chǎn)物片段的DNA序列分析[10]。

③細菌基因組的recA擴增[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

對實驗室保存的121株乳酸菌進行抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)有45株對三種指示菌有較強的抑制作用。選取這45株菌進行復(fù)篩實驗。乳酸菌屬于G+菌，傳統(tǒng)觀點認為G+菌的抑菌范圍僅限于其他G+菌，但后來發(fā)現(xiàn)一些G+菌所產(chǎn)細菌素的抑菌譜可以顯著擴大，對一些G-菌也有抑制作用[13]。本實驗篩選出一些乳酸菌菌株對G+菌和G-菌均有抑制作用。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

經(jīng)過酸排除、過氧化氫排除實驗，從豬糞中分離出的編號為ZZU 575的乳酸菌抑菌活性較強，其發(fā)酵上清液在不同條件下對指示菌的抑菌活性如表1所示，pH值調(diào)至5.0的MRS液體培養(yǎng)基對三種指示菌都沒有抑制作用，說明這三種指示菌可以耐受pH值5.0的環(huán)境。在排除酸的作用后，菌株ZZU 575的上清液對大腸桿菌的抑制作用消失。但排除酸和過氧化氫作用后，菌株ZZU 575對藤黃微球菌及沙門氏菌仍具有較強的抑制活性，說明該菌株發(fā)酵上清液中存在除酸和過氧化氫以外的其它抑菌物質(zhì)。

表1 ZZU 575的抑菌效果

將菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液進行胰蛋白酶和蛋白酶K的酶解實驗，發(fā)現(xiàn)在加入胰蛋白酶后抑菌活性微弱，加入蛋白酶K后的抑菌活性消失，說明菌株ZZU 575發(fā)酵上清液中存在細菌素類抑菌物質(zhì)。

2.3 細菌素生物學特性的初步鑒定

2.3.1 熱敏感性

菌株ZZU 575發(fā)酵上清液在不同溫度處理下的抑菌效果如表2所示，菌株ZZU 575產(chǎn)生的細菌素表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。在60℃和80℃條件下熱處理30 min和60 min，抑菌活性基本保持不變，說明在低于或等于80℃條件下該抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性較強。但隨著溫度繼續(xù)升高，其活性受到影響，在100℃條件下處理30 min或60 min,活性有所減弱，在121℃處理15 min后，抑菌活性消失。

表2 溫度對細菌素抑菌活性的影響

2.3.2 pH敏感性

將菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液調(diào)至不同的pH值后分別進行抑菌實驗，抑菌效果如表3所示。表3結(jié)果表明，在pH值2.0～6.0范圍內(nèi)，菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液對沙門氏菌和藤黃微球菌均有抑制作用；當pH值≥7.0時，菌株產(chǎn)生的細菌素基本無抑菌活性。

2.4 菌株ZZU 575的鑒定

表3 pH值對抑菌活性的影響

2.4.1 菌落形態(tài)

菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊。

2.4.2 菌株的形態(tài)及生理生化特性（見表4）

表4 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果

由表4可以看出，菌株ZZU 575可以在10℃低溫下生長良好，而對45℃、50℃高溫及5℃低溫的耐受能力微弱；可以在pH值3.0～9.0的范圍內(nèi)生長良好；可以耐受3.5%及6.5%的鹽濃度。

2.4.3 碳源發(fā)酵實驗結(jié)果（見表5）

由表5可知，菌株ZZU 575可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇等18種碳源，對攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鹽有微弱利用。

2.4.4 16S rRNA序列分析

將測得的16S rDNA序列與通過Blast在Gen?Bank中檢測得到的標準菌株序列信息通過CLUSTAL W軟件比對。采用鄰接法構(gòu)建進化樹（neighbor-joining method），如圖1所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。

根據(jù)菌株的生理生化性狀，和其在系統(tǒng)進化樹上的位置，將菌株ZZU 575初步鑒定屬于植物乳桿菌群。將其和4株標準菌株L.plantarum sub?sp.plantarum，L.plantarum subsp.argentoratensis，L.pentosus，L.paraplantarum進行recA基因部分擴增產(chǎn)物的比對。結(jié)果如圖2所示。菌株ZZU 575和標準菌株植物乳桿菌一樣具有相同的recA基因擴增產(chǎn)物（318 bp）。因此ZZU 575被鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum subsp.plantarum)。

3 討論

對實驗室保存的乳酸菌進行抑菌活性實驗后，篩選到一株有較強抑菌活性的乳酸菌菌株ZZU 575，這株乳酸菌在排除有機酸和過氧化氫的作用后仍有抗菌活性，而蛋白酶K，胰蛋白酶的作用可以使其抑菌活性明顯下降甚至喪失，這與已報道的細菌素Sakacin C2[14]情況類似，初步說明菌株ZZU 575產(chǎn)生的是蛋白類抑菌物質(zhì)，有可能是一類細菌素。決定細菌素應(yīng)用價值的關(guān)鍵因素是

細菌素的穩(wěn)定性，因其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，各類細菌素的穩(wěn)定性不一樣。細菌素的穩(wěn)定性主要受到溫度和pH值的影響，對溫度而言，不同的細菌素對溫度的敏感性不同，本實驗篩選的菌株ZZU 575的抑菌物質(zhì)在60～80℃高溫處理后抑菌作用基本保持穩(wěn)定。溫度高于100℃時抑菌活性明顯降低，推測原因可能是高溫使多肽或者蛋白質(zhì)的高級構(gòu)象和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致多肽或蛋白質(zhì)失活，從而使得細菌素活性降低。對pH值而言，大部分細菌素在酸性條件下穩(wěn)定，在中性和堿性條件下活性降低或失活，菌株ZZU 575產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在酸性條件下活性較強，表明其抑菌物質(zhì)可以在弱酸性的青貯飼料中發(fā)揮作用。

表5 碳源發(fā)酵實驗結(jié)果

圖1 ZZU 575的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹

圖2 recA基因擴增產(chǎn)物分析

在對菌株ZZU 575進行鑒定中發(fā)現(xiàn)單憑該菌株的生理生化，碳源發(fā)酵特征很難將其鑒定到種的水平。通過16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)ZZU 575歸于Lactobacillus屬，但不能明確鑒定到種，因此又補充了recA基因擴增產(chǎn)物分析。結(jié)果顯示菌株ZZU 575屬于植物乳桿菌(L.plantarum subsp.plantarum)。菌株ZZU 575所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的分離純化及作用機理等有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究篩選到一株高抗菌活性乳酸菌，對G+菌和G-菌均有抑制作用，且其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在酸性條件下活性較強，在60～80℃高溫范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。該菌在10～40℃、pH值3.0～9.0環(huán)境中生長良好，能夠耐受6.5%的鹽濃度。以上結(jié)果表明該菌株在青貯飼料中具有潛在應(yīng)用價值。