體外透析法評(píng)定單胃動(dòng)物飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)

■陳 亮 張宏福 趙 峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中客觀、準(zhǔn)確評(píng)定各種飼料原料的生物學(xué)效價(jià)是建立營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化飼料配方的基礎(chǔ)性科學(xué)決策依據(jù)，也是提高飼料利用率，降低飼料成本及節(jié)能減排的重要手段。飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)（bioavailability）評(píng)定的宗旨是為了揭示飼料被畜禽采食后消化、吸收，經(jīng)過(guò)動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入相應(yīng)的組織器官，再轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品的過(guò)程。在表達(dá)消化、代謝、轉(zhuǎn)化的過(guò)程及其涵義方面，前人曾提出種種倡議，如表1所示。

養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)常利用動(dòng)物體內(nèi)（in vivo）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)定。體內(nèi)法既耗時(shí)費(fèi)力，又受不可控的生理因素和實(shí)驗(yàn)條件而致結(jié)果迥異。因此，需要快速、可標(biāo)準(zhǔn)化的體外（in vitro）評(píng)定方法。在體外消化實(shí)驗(yàn)中，需采用不同的消化酶模擬不同段消化道的消化過(guò)程，并將己消化可吸收養(yǎng)分和不可吸收養(yǎng)分進(jìn)行分離。期間離心、抽濾、沉淀和過(guò)濾等方法常帶來(lái)較大的測(cè)定誤差。透析方法自Thomas Graham 1861年首次提出至今已有100多年，并在各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在評(píng)定養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)方面，體外透析法（in vitro dialysis cell meth?od）也成為研究的熱點(diǎn)，具體方法常以透析袋、透析液體系、攪拌器、恒溫水浴為系統(tǒng)組成的胃腸模擬器。通常，在模擬飼料的消化時(shí)，先將一定重量的飼料裝入三角瓶等容器中，加入模擬胃液后在恒溫水浴搖床上振動(dòng)消化一段時(shí)間，再將三角瓶中物質(zhì)用堿中和后用模擬小腸液無(wú)損失地轉(zhuǎn)移到透析袋中，再將透析袋放在流動(dòng)透析液系統(tǒng)中繼續(xù)消化。消化結(jié)束后直接測(cè)定透析袋中的物質(zhì)（視為未消化物質(zhì)）；或者收集和分析透析液，將透析液中的物質(zhì)視為已消化物質(zhì)。由于體外透析法將體外酶促反應(yīng)和產(chǎn)物分離過(guò)程合二為一，使消化產(chǎn)物不斷的去除，消除產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的抑制作用，這類似于動(dòng)物腸道的吸收，從而可獲取更加逼真的養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的數(shù)據(jù)。

表1 飼料生物學(xué)效價(jià)定義

1 體外透析法的應(yīng)用與發(fā)展

體外透析法的研究始于上世紀(jì)50年代，源于Mauron等(1955)的原創(chuàng)思想。將體外消化反應(yīng)置于透析袋中進(jìn)行，最初用于測(cè)定蛋白和氨基酸的消化率，對(duì)礦物質(zhì)元素特別是磷的透析率的研究逐漸較多，近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室基于程控的仿生消化系統(tǒng)對(duì)飼料有效能的評(píng)定研究受到國(guó)內(nèi)外同行關(guān)注。以下從飼料主要養(yǎng)分的評(píng)定方面對(duì)體外透析法進(jìn)行綜述，具體研究結(jié)果如表2所示。

表2 體外透析法的研究應(yīng)用

Gauthier等(1982)和Savoie等(1986)建立了一套胃蛋白酶——胰酶去除產(chǎn)物消化法，測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率。據(jù)報(bào)道該法不僅可用于檢測(cè)不同飼料中蛋白質(zhì)的消化率，也能檢出熱處理對(duì)乳清蛋白中賴氨酸的破壞度和測(cè)定不同加工食物蛋白中氨基酸的體外消化率。該方法測(cè)定的粗蛋白質(zhì)和氨基酸體外消化率和動(dòng)物試驗(yàn)法表觀消化測(cè)值呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，因此，認(rèn)為可以利用體外透析法測(cè)定的粗蛋白質(zhì)和氨基酸消化率來(lái)預(yù)測(cè)表觀消化率。在評(píng)定飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)方面，該方法雖與未去除產(chǎn)物方法相比更科學(xué)合理，但未考慮到膽鹽等對(duì)蛋白質(zhì)消化率的影響。Handan等(2009)采用透析法，使用處理過(guò)的魚消化器官（如：胃、十二指腸和盲腸等）作為酶源，引入膽鹽和酸處理，測(cè)定蛋白飼料的生物學(xué)效價(jià)，并研究了如胃期消化時(shí)間、反應(yīng)溫度等影響因素。結(jié)果表明：與僅小腸期消化相比，加入酸處理氨基酸釋放量增加兩倍；添加膽鹽可提高飼料蛋白質(zhì)消化率約2.5倍，這可能由于膽鹽可激活胰蛋白酶和糜蛋白酶原活性水解蛋白質(zhì)。Drake等(1991)建立了胃蛋白酶—胰酶不連續(xù)體外透析法，在使用透析技術(shù)的基礎(chǔ)上，引入了非內(nèi)源性的高溫淀粉酶，旨在使該體外消化模擬技術(shù)不但可用于測(cè)定飼料蛋白質(zhì)的消化率，而且可對(duì)飼料淀粉消化率進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步擴(kuò)大評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)成分的范圍。

體外透析法也用于評(píng)定飼料礦物質(zhì)的生物學(xué)效價(jià)研究。Miller等(1981)首先利用體外透析法評(píng)定鐵的生物學(xué)效價(jià)。在使用胃蛋白酶模擬小腸消化后，加入胰酶和膽汁模擬小腸消化；并在模擬小腸消化時(shí)，通過(guò)平衡透析法獲取透析物，模擬了不溶性鐵的消化和吸收，與體內(nèi)鐵和外源放射性鐵的測(cè)值取得了很好的相關(guān)性。但存在透出物不及時(shí)移除，而產(chǎn)生較低的透析率。Minihane等(1993)使用連續(xù)透析法，將透出物不斷的移除；pH值在30 min內(nèi)自動(dòng)調(diào)節(jié)。Promchan等(2005)，Shiowata?na等(2006)研發(fā)一種較為便捷的連續(xù)透析方法(dy?namic continuous- fl ow dialysis,CFD)，礦物質(zhì)含量和透析液pH值可分別通過(guò)電熱原子吸收光譜和pH計(jì)量器測(cè)定，并用該法測(cè)定牛奶中鐵、鈣的透析率。體外透析法評(píng)定磷的生物學(xué)效價(jià)的相關(guān)研究報(bào)道較多。Zyla等(1995)利用透析法獲得的水解磷值與3周齡體重(R=0.986)、牙齒灰分(R=0.952)、攝入飼料量(R=0.994)和飼料報(bào)酬(R=0.992)等均具有強(qiáng)相關(guān)性；磷酸、蛋白酶和纖維素酶可增加體外透析磷的釋放。Liu等(1997)采用體外透析法評(píng)定了10種植物性飼料磷的透析率，并建立了透析率與磷的表觀消化率之間的回歸關(guān)系，體外水解磷與體內(nèi)磷的消化率和生長(zhǎng)性能具有強(qiáng)相關(guān)(r=0.999)。方熱軍(2003)測(cè)定了19種植物性飼料和2種混合飼糧中磷的透析率，建立飼料可透析磷的預(yù)測(cè)模型。體外透析法也用于研究酶制劑對(duì)單胃動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響。利用體外透析法研究表明：添加植酸酶能提高動(dòng)物磷的消化率；添加不同類型非淀粉多糖酶（如：木聚糖酶、β-葡聚糖酶或纖維素酶）可提高玉米日糧和雙低菜粕日糧的生物學(xué)效價(jià)測(cè)值；并與體內(nèi)的測(cè)試結(jié)果具有一致性。除了使用透析袋作為透析外，Wolters等(1993)使用中空纖維系統(tǒng)作為透析，研究評(píng)定礦物質(zhì)和微量元素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，結(jié)果與Miller等(1981)測(cè)定Zn、Cu和Fe的透析率具有一致性。

從體外透析法的總體應(yīng)用看，主要模擬胃和小腸的消化，常是先在酸性條件下進(jìn)行胃的消化，再利用透析袋模擬小腸的消化和吸收。針對(duì)雞的生理特點(diǎn)，有學(xué)者加入了嗉囊期的模擬；而進(jìn)行豬的有效能評(píng)定時(shí)加入了大腸期。使用的消化酶常有胃蛋白酶、胰酶/仿生小腸酶以及大腸酶（如纖維素酶），也有采用處理過(guò)的消化器官組織作為酶源。這些研究中主要選用截留分子量為12 000～14 000 Da的透析袋居多。以豬飼料消化率測(cè)定研究為主，家禽次之，近年水生動(dòng)物的研究報(bào)道逐漸增多。

2 體外仿生評(píng)定法關(guān)鍵影響因素評(píng)析

2.1 透析袋孔徑

透析袋的孔徑是影響飼料養(yǎng)分體外消化率的主要因素。Gauthier等認(rèn)為，選用不同孔徑的透析袋會(huì)導(dǎo)致分離出來(lái)的蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物分子量通常偏大或偏小，選用何種透析袋應(yīng)該與畜禽消化道能夠同時(shí)吸收氨基酸和小肽的實(shí)際情況相符。透析袋孔徑大小對(duì)飼料養(yǎng)分消化率的影響與消化時(shí)間長(zhǎng)短又有直接關(guān)系。采用不同孔徑的透析袋在消化較長(zhǎng)時(shí)間后，測(cè)定的體外消化率則無(wú)顯著差異，這主要是隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分被分解成小肽段，均能夠通過(guò)截留分子量較小的透析袋。也有報(bào)道認(rèn)為飼料養(yǎng)分在體外消化過(guò)程中大部分仍是以大分子的形式存在，當(dāng)采用孔徑較大的透析袋時(shí)，粗蛋白和淀粉的消化率均顯著高于截留分子量小的透析袋，如果采用截留分子量過(guò)小的透析袋，則會(huì)將一些在體內(nèi)可消化吸收的養(yǎng)分人為地認(rèn)為其為不可吸收部分。由于不同種類的動(dòng)物消化道存在差異，透析袋的孔徑也應(yīng)該酌情篩選。如豬的食糜在消化道內(nèi)的停留時(shí)間較長(zhǎng)，大部分飼料養(yǎng)分以較小分子量的物質(zhì)形式存在；而食糜在雞消化道內(nèi)的停留時(shí)間相對(duì)較短，有相當(dāng)一部分飼料養(yǎng)分是以分子量較大的寡肽和寡糖形式存在。因此，在使用體外透析法評(píng)定養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)時(shí)，由于體外消化不可能完全模擬體內(nèi)的情況，只有針對(duì)特定的飼料類型和模擬對(duì)象，選取適宜孔徑的透析袋，避免千篇一律的模式，才能獲得更加逼真的結(jié)果。

2.2 透析方式

從不同透析方法對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率的影響研究發(fā)現(xiàn)，增加透析液的更新頻率也能夠增加氮的消化率。而用間歇置換透析液的方法測(cè)得的蛋白質(zhì)的消化率較低，尤其是置換透析液的間隔越長(zhǎng)消化率越低。說(shuō)明分解產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)有顯著的抑制作用，因此透析方式在體外消化模擬技術(shù)中非常關(guān)鍵。連續(xù)透析能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)消化產(chǎn)物不斷轉(zhuǎn)移走，使透析袋內(nèi)外始終保持較高的已消化養(yǎng)分濃度差，蛋白質(zhì)消化率明顯高于間歇透析。

2.3 模擬消化酶及消化液環(huán)境

針對(duì)不同動(dòng)物、不同飼料養(yǎng)分應(yīng)該采用相應(yīng)的體外模擬酶及消化液環(huán)境，且這些條件應(yīng)遵循動(dòng)物體內(nèi)消化的實(shí)際情況。消化酶種類、濃度、酶促反應(yīng)時(shí)間、pH值、溫度、透析液及其體積和流速等反應(yīng)環(huán)境都會(huì)影響體外透析率。消化酶方面，各研究者主要選取胃蛋白酶和胰酶為主，認(rèn)為它們?yōu)閯?dòng)物體內(nèi)主要的消化酶，選用氨肽酶等太多的消化酶會(huì)引入更多的誤差，影響氮的測(cè)定。這些重要參數(shù)的確立應(yīng)兼顧方法的穩(wěn)定性和反映動(dòng)物體內(nèi)的真實(shí)情況，以體內(nèi)數(shù)據(jù)為支撐。一味追求體外消化率最大化或不切實(shí)際地追求與體內(nèi)測(cè)值一致性而不顧方法的穩(wěn)定性來(lái)確定模擬參數(shù)就會(huì)顯得形而上學(xué)。同時(shí)，針對(duì)特定動(dòng)物、飼料或日糧所獲取的消化參數(shù)都是有條件性的，不可以偏概全。

3 單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)

在諸多的國(guó)內(nèi)外研究者報(bào)道的體外仿生技術(shù)，幾乎都存在將胃蛋白酶消化飼料的混合物轉(zhuǎn)移到透析袋的人工操作。組件基本上停留在燒杯或三角瓶、透析袋、搖床等傳統(tǒng)設(shè)備。無(wú)論從仿生的角度及從所獲參數(shù)的可比性與可重復(fù)性等方面都具有很大的局限性。雖也出現(xiàn)半自動(dòng)化或自動(dòng)化的消化裝置，如荷蘭TNO研制的豬全消化道仿生系統(tǒng)和加拿大2005年研制的人類上段胃腸仿生消化系統(tǒng)，但均引入了以中空纖維超濾管為吸收裝置，不能反映養(yǎng)分消化生理及生物學(xué)效價(jià)評(píng)定中的“全進(jìn)全出”的概念，僅用于胃腸道微生物生長(zhǎng)、藥理代謝、有害物殘留等方面的研究。為此，本實(shí)驗(yàn)室從上個(gè)世紀(jì)后期開(kāi)始，就仿生酶譜的設(shè)計(jì)定型的依據(jù)，消化過(guò)程中水解環(huán)境、消化液的加入、乃至水解產(chǎn)物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統(tǒng)、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制、反應(yīng)溫度、消化時(shí)長(zhǎng)等因素的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范等方面的立論依據(jù)開(kāi)展了系統(tǒng)研究，特別是創(chuàng)制了基于體外透析技術(shù)的程控“單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)（Simulative Digestive System,SDS）”。與眾多報(bào)道的體外透析法相比，該系統(tǒng)具有：體外酶消化的都在透析袋中進(jìn)行，避免了不同消化期間反應(yīng)物的轉(zhuǎn)移損失而帶來(lái)的測(cè)定誤差；使用的消化酶均根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)起主要作用的酶種類、濃度和比例，克服了選擇酶譜的隨意性；采用可程控系統(tǒng)能減少由于人工操作而引起的結(jié)果平行性差等缺陷。同時(shí)，該方法還使已消化養(yǎng)分與未消化養(yǎng)分復(fù)雜的分離過(guò)程簡(jiǎn)單化，并提高了重演性和相關(guān)性。

4 小結(jié)

以體外透析法為基點(diǎn)，是迄今研究創(chuàng)制飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)簡(jiǎn)捷、標(biāo)準(zhǔn)化方法的方向，可為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量研究和飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定提供一種“度量衡”基準(zhǔn)和手段。但任何仿生方法的建立，還并不能實(shí)現(xiàn)比動(dòng)物試驗(yàn)法更深入揭示養(yǎng)分在畜禽畜禽體內(nèi)的消化、吸收和轉(zhuǎn)化利用的情況，一味追求這種所謂“真實(shí)”狀況也是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究本身面臨的現(xiàn)實(shí)難題。

（參考文獻(xiàn)32篇，刊略，需者可函索）