運(yùn)用體外法評(píng)定不同微生物制劑對(duì)稻草處理效果

■付戴波 許宇薇 瞿明仁 游金明 歐陽(yáng)克蕙 宋小珍 易中華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045）

江西省是我國(guó)水稻種植大省。氣候條件優(yōu)越，雨熱同季，適宜水稻生長(zhǎng)，稻草產(chǎn)量巨大，但利用率過(guò)低，主要利用方式為作為肥料還田或直接燃燒，作飼料用的僅占16.2%，遠(yuǎn)低于其他秸稈的飼料利用率（22.6%），而被焚燒和棄置的占10.9%，資源浪費(fèi)和環(huán)境污染嚴(yán)重。稻草是一種常見(jiàn)的粗飼料，粗纖維含量在30%以上，蛋白含量?jī)H為3%～5%，適口性差，家畜采食量低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值過(guò)低，飼用價(jià)值不高。因此，如何充分合理有效地利用作物秸稈，是當(dāng)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重大課題。本試驗(yàn)采用不同微生物制劑對(duì)稻草進(jìn)行處理，研究其在瘤胃體外發(fā)酵指標(biāo)影響，探討適宜的稻草微生物制劑或組合，旨在為稻草充分利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

選擇在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究基地牛場(chǎng)體況良好，裝有永久性瘤胃瘺管的3頭錦江黃牛，體重300 kg左右。單舍飼養(yǎng)，其日糧由精料與粗料組成，精粗比為2∶8，基礎(chǔ)日糧為玉米-麥麩-稻草型，精料購(gòu)于江西華達(dá)牧業(yè)有限公司，精料的配方組成為玉米、麥麩、豆粕、棉粕、碳酸鈣、磷酸氫鈣、食鹽、維生素（A、D3、E、煙酸）微量元素（CuSO4、FeSO4、ZnSO4、MnSO4、NaSeO3、KI、CoCl2）及防霉劑等。表1為試驗(yàn)牛日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平。于每日早8點(diǎn)與晚8點(diǎn)飼喂日糧，先粗后精，自由飲水，試驗(yàn)期間采集試驗(yàn)牛瘤胃液供體外培養(yǎng)。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 試驗(yàn)材料

稻草：試驗(yàn)所用稻草取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室牛場(chǎng)。

添加劑：從市場(chǎng)選用A、B、C 3種微生物處理劑，其主要有效成分如表2所示。

表2 微生物制劑主要成分及添加量

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子重復(fù)設(shè)計(jì)，采用3種添加劑及其不同組合，共7種處理，每個(gè)處理設(shè)2個(gè)重復(fù)。7種處理組分別為：A處理組、B處理組、C處理組、A+C處理組、B+C處理組、A+B處理組、A+B+C處理組。

1.4 體外批次培養(yǎng)裝置

培養(yǎng)裝置主體為恒溫水浴搖床，水浴溫度和震蕩頻率可調(diào)，酸奶瓶（容積為150 ml）作為培養(yǎng)瓶，瓶口安裝帶塑料管的橡皮塞，同時(shí)，塑料管帶有可打開(kāi)和關(guān)閉的塑料三通閥以保證厭氧環(huán)境，塑料三通管與醫(yī)用注射器相連接。試驗(yàn)前所用培養(yǎng)瓶，注射器及玻璃器皿均用超聲波清洗儀清洗，高壓滅菌，烘干備用。

1.5 人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液的配制

緩沖試劑和常量元素溶液(A液)：稱取K2HPO4382.51 mg、KH2PO4292 mg、(NH4)2SO4480 mg、NaCl 200 mg、MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO34 000 mg，將上述試劑混合后加入蒸餾水定容至1 000 ml。該溶液使用前1 d配制待用。

微量元素溶液（B液）：準(zhǔn)確稱取EDTA 500 mg、FeSO4·7H2O 200 mg、MnCl·4H2O 200 mg、ZnSO4·7H2O 10 mg、H3BO330 mg、CoCl2·6H2O 20 mg、Cu-Cl2·6H2O 1 mg、NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO43 mg，將上述試劑混合后加蒸餾水定容至1 000 ml。持續(xù)通入CO218 h后，蓋嚴(yán)瓶口，至于冰箱備用。

還原劑溶液（C液）：稱取25 g Na2S·9H2O加入80 ml蒸餾水溶解后定容至100 ml，持續(xù)通入CO220 min后，蓋嚴(yán)瓶口，置于冰箱中備用。

人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液制備：準(zhǔn)確量取790.4 ml A液，8 ml B液，經(jīng)充分混合后持續(xù)通入CO218 h，于培養(yǎng)前1 h加入1.6 ml C液，充分混合，分裝到培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中分裝40 ml，通入CO2氣體5 min，裝上安有三通閥的橡皮塞，三通閥處于關(guān)閉狀態(tài)，放于恒溫水浴搖床中預(yù)熱至39℃待用。

1.6 瘤胃液的采集與制備

于早8：00晨飼后在3頭試驗(yàn)牛瘤胃的上下左右不同點(diǎn)各采集400 ml瘤胃液，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后裝入預(yù)熱至39℃并通有CO2氣體的保溫瓶中，迅速返回實(shí)驗(yàn)室，使用39℃預(yù)熱的量筒量取所需瘤胃液分裝到培養(yǎng)瓶，每個(gè)瓶中分裝20 ml瘤胃液，一份瘤胃液加入兩份緩沖液中，混合均勻，接通培養(yǎng)瓶和注射器，打開(kāi)三通閥，開(kāi)啟震蕩開(kāi)關(guān)，進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.7 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取7組微生物制劑處理稻草樣品4 g，轉(zhuǎn)移入已裝有人工瘤胃液的培養(yǎng)瓶中，然后進(jìn)行0、12、24、36、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的體外批次培養(yǎng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，在相應(yīng)設(shè)置時(shí)間點(diǎn)取出處理的所有培養(yǎng)瓶，將樣品預(yù)處理，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。正常稻草作為對(duì)照組。

1.8 測(cè)定指標(biāo)與方法

產(chǎn)氣量測(cè)定：分0～6、6～12、12～24、24～36、36～42 h等5個(gè)時(shí)間段，記錄每個(gè)時(shí)間段產(chǎn)氣量。

氨態(tài)氮測(cè)定：參照馮宗慈《通過(guò)比色測(cè)定瘤胃液氨氮含量方法的改進(jìn)》（比色法）方法測(cè)定。

BCP測(cè)定：采用王放（1990）改進(jìn)方法測(cè)定。取去除原蟲(chóng)和飼料大顆粒的上清液10 ml，以16 000×g離心20 min，棄去上清液，沉淀部分加入9 ml 10%三氯乙酸溶液，混勻，再以4 000 r/min離心10 min，取沉淀物加入5%氫氧化鈉溶解，然后稀釋至25 ml。此稀釋液又經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液在紫外分光光度計(jì)上用280 nm和260 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色。應(yīng)用下面公式求得細(xì)菌蛋白質(zhì)含量：

細(xì)菌蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本處理采用Excel軟件，結(jié)果分析先采用SPSS17.0中One-way-ANOVA進(jìn)行方差分析，并利用Duncan程序進(jìn)行均值的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物制劑及組合處理微貯稻草對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響

不同處理微貯稻草對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。總體來(lái)看，各處理組產(chǎn)氣規(guī)律大致相似，產(chǎn)氣量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。以培養(yǎng)6～12 h各組產(chǎn)氣量達(dá)到最大值，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)氣量逐漸下降。

表3 不同微生物制劑對(duì)稻草體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響(ml)

從各培養(yǎng)時(shí)間段來(lái)看，培養(yǎng)0～6 h處理A、C、B+C、A+B組產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），處理A+B組產(chǎn)氣量最高，為12.25 ml。培養(yǎng)6～12 h后，處理A、A+C、B+C、A+B組產(chǎn)氣量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），以處理A+B組產(chǎn)氣量最高，為16.50 ml。培養(yǎng)12～24 h各組產(chǎn)氣量開(kāi)始下降，但處理A、B+C、A+B組產(chǎn)氣量仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），以處理A組產(chǎn)氣量最高，為9.00 ml。培養(yǎng)24～36 h各組產(chǎn)氣量持續(xù)下降，處理A+C組產(chǎn)氣量低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05），其他處理組產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，處理A、B+C、A+B組產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。體外培養(yǎng)36～48 h，各組產(chǎn)氣量降到最低，處理B、A+C、B+C組產(chǎn)氣量低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05），其余處理組產(chǎn)氣量高于對(duì)照組，其中處理A組產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

從3種不同微生物制劑及組合來(lái)看，以A制劑總產(chǎn)氣量最大，C次之，B最小；從組合來(lái)看，A+B組合總產(chǎn)氣量最大，然后依次為B+C、A+C、A+B+C。

2.2 不同微生物制劑及組合處理微貯稻草對(duì)培養(yǎng)液中氨態(tài)氮濃度的影響（見(jiàn)表4）

表4 不同微生物制劑對(duì)稻草培養(yǎng)液中NH3-N濃度的影響（mg/100 ml）

總體來(lái)說(shuō)，無(wú)論是對(duì)照組還是微生物制劑處理組，培養(yǎng)液中NH3-N濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步下降趨勢(shì)。

從各組來(lái)看，培養(yǎng)6 h后，除A組NH3-N濃度比對(duì)照組低（但差異不顯著，P＞0.05）外，其余各處理組均比對(duì)照組高，其中A+B+C組NH3-N濃度最高，而且顯著高于對(duì)照組和其他組（P＜0.05）；培養(yǎng)12 h后，B、C、A+B、A+C、A+B+C組顯著高于A組和對(duì)照組（P＜0.05），A+B+C組NH3-N濃度最高。培養(yǎng)24 h后，A+B+C組NH3-N濃度最高，并顯著高于其余處理組和對(duì)照組（P＜0.05），以A組最低但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)36 h和48 h，仍然以A+B+C組NH3-N濃度最高，并顯著高于其余處理組和對(duì)照組（P＜0.05），以A最低，但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同微生物制劑及組合處理微貯稻草對(duì)培養(yǎng)液中BCP濃度的影響

不同微生物制劑處理稻草體外瘤胃培養(yǎng)液中BCP含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。從各時(shí)間點(diǎn)來(lái)看，BCP濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組BCP濃度均高于對(duì)照組。6 h以B組BCP濃度最高，12、24、36、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)以A+B+C處理組BCP濃度最高。各組以0～24 h培養(yǎng)液中BCP濃度上升較快，24～48 h培養(yǎng)液中BCP濃度仍然呈上升趨勢(shì)，但是上升速度較慢。

表5 不同微生物制劑對(duì)稻草培養(yǎng)液中BCP濃度的影響（mg/100 ml）

從各組BCP濃度來(lái)看，培養(yǎng)6 h B組BCP濃度最高，而且顯著高于B+C組(P＜0.05)，其余各理組BCP濃度與對(duì)照組相比均有所升高，但差異不顯著(P＞0.05)，且各處理組之間差異也不顯著。培養(yǎng)到12 h，處理A、B、C、A+B+C組的BCP濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，以A+B+C組的BCP濃度最大，達(dá)到13.42 mg/100 ml，比對(duì)照組高出2倍；培養(yǎng)24 h后，處理C、A+C、A+B、A+B+C組BCP濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），同樣以A+B+C組的BCP濃度最大，同時(shí)顯著高于A、B、C、B+C組（P＜0.05）。其余各處理組BCP濃度差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)36 h后，各處理C、A+C、A+B、A+B+C組BCP濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），以A+B+C組的BCP濃度最大，同時(shí)顯著高于A、B、C、B+C組（P＜0.05）。其余各處理組BCP濃度差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)48 h后，A+C、A+B、A+B+C顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），也是以A+B+C組的BCP濃度最大，A、B、C、B+C組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同微生物制劑及組合微貯稻草對(duì)培養(yǎng)液中產(chǎn)氣量、氨氮、BCP濃度相關(guān)性分析

對(duì)上述不同處理微貯稻草對(duì)培養(yǎng)液中48 h總產(chǎn)氣量、BCP含量、氨氮濃度相關(guān)性分析，得出如下回歸方程：

①Y=-0.061 3X+9.010 8（Y為培養(yǎng)液中NH3-N濃度，X為48 h總產(chǎn)氣量，R2=0.187 8）。

② Y=0.110 9X+12.315（Y為培養(yǎng)液中BCP濃度，X為48 h總產(chǎn)氣量，R2=0.102 8）。

③ Y=1.214X+10.232（Y為培養(yǎng)液中BCP濃度，X為培養(yǎng)液中NH3-N濃度，R2=0.677 8）。

從上述相關(guān)性分析可見(jiàn)，培養(yǎng)液中BCP濃度與NH3-N濃度呈現(xiàn)中等相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2為0.677 8。而培養(yǎng)液中NH3-N、BCP濃度與48 h總產(chǎn)氣量呈現(xiàn)弱相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.187 8、0.102 8。

3 討論

3.1 不同微生物制劑處理稻草對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，微生物制劑A、C及A+B組合處理組的產(chǎn)氣量高于對(duì)照組，其中處理A組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明單獨(dú)使用A、C或A+B組合微生物制劑對(duì)稻草進(jìn)行發(fā)酵均有促進(jìn)作用，有可能提高稻草有機(jī)物質(zhì)的消化率。

不同的微生物制劑由于菌種或活性物質(zhì)不同，其對(duì)稻草體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量有不同影響，本研究結(jié)果表明：以A制劑總產(chǎn)氣量最大，C次之，B最??；不同的微生物制劑之間存在組合效應(yīng)，各組合產(chǎn)氣量依次為A+B、B+C、A+C、A+B+C。A+B組合總產(chǎn)氣量最大，處理稻草后培養(yǎng)發(fā)酵最激烈，有可能稻草的有機(jī)物質(zhì)消化率最高，實(shí)際情況如何有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同處理微貯稻草對(duì)培養(yǎng)液中氨氮、BCP濃度的影響

氨氮濃度一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3的速度以及微生物對(duì)NH3利用情況。瘤胃液中的氨是蛋白質(zhì)在微生物降解和合成過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。瘤胃微生物中，大約有80%的細(xì)菌以氨作為氮源。瘤胃內(nèi)氨濃度過(guò)低，瘤胃微生物生長(zhǎng)緩慢，碳水化合物的分解利用也受阻。反之，如果合成速度比降解速度快，則氨會(huì)在瘤胃內(nèi)積聚并超過(guò)微生物能利用的最大氨濃度，以尿的形式排出，造成氨的浪費(fèi)。因此，瘤胃內(nèi)適當(dāng)?shù)陌钡獫舛仁潜ＷC瘤胃微生物蛋白合成效率的重要條件。有學(xué)者研究表明，瘤胃微生物生長(zhǎng)最適的NH3-N濃度為5～28 mg/100 ml。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種微生物制劑及其組合處理組，各時(shí)間點(diǎn)NH3-N濃度均比對(duì)照組高，而且均在瘤胃微生物生長(zhǎng)最適的NH3-N濃度范圍內(nèi)。3種微生物制劑及其組合處理組BCP濃度均比對(duì)照組高。對(duì)照組稻草未經(jīng)微生物處理，NH3-N濃度偏低，不能為瘤胃微生物提供充足的氮源，因此，其BCP濃度在各時(shí)間點(diǎn)都很低。從培養(yǎng)液中BCP濃度與NH3-N濃度相關(guān)性（呈現(xiàn)中等相關(guān)R2=0.677 8）也說(shuō)明了這一關(guān)系。

從3種微生物制劑及其組合NH3-N、BCP濃度總體來(lái)看，單獨(dú)使用以C制劑最好，聯(lián)合使用以A+B+C組合最好。其原因可能是微生物制劑及其組合處理稻草，促進(jìn)了微生物的大量繁殖，分泌的纖維素酶降解了稻草細(xì)胞壁，分解纖維物質(zhì)，得到更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為瘤胃微生物合成BCP提供大量的氮源及能量。

4 小結(jié)

①微生物制劑A、C及A+B組合處理組的產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，其中處理A組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），單獨(dú)使用以A制劑總產(chǎn)氣量最大，聯(lián)合使用以A+B組合總產(chǎn)氣量最大。

②除微生物制劑處理A組外，3種微生物制劑及其組合處理組NH3-N濃度均高于對(duì)照組，并且微生物制劑C及A+B+C組合顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而且均在瘤胃微生物生長(zhǎng)最適的NH3-N濃度范圍內(nèi)。

③3種微生物制劑及其組合處理組BCP濃度均高于對(duì)照組，并且微生物制劑A+B+C組合效果最好。

④從NH3-N、BCP濃度綜合考慮，單獨(dú)使用以C制劑最好，聯(lián)合使用以A+B+C組合最好。

⑤培養(yǎng)液中BCP濃度與NH3-N濃度呈現(xiàn)中等相關(guān)，其回歸方程為：Y=1.214X+10.232（Y為培養(yǎng)液中BCP濃度，X為為培養(yǎng)液中NH3-N濃度，R2=0.677 8）。

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）