瘤胃微生物體外降解稻秸和紫花苜蓿干草粉試驗

■付釣鈞 周清波 李佳琳 李春豐 王長平 趙瑞艷 戴志江

（1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯市獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站，黑龍江佳木斯 154007）

農作物秸稈具有多功能性，可用作燃料、肥料、飼料、工業(yè)原料、生物基料等，與廣大農民的生活和生產息息相關。高效開發(fā)和集約利用農作物秸稈資源，有利于改善農村生產生活條件，促進農業(yè)增效和農民增收，對發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟，構建資源節(jié)約型社會，推進社會主義新農村建設等具有重要意義[1]。本試驗是通過用牛的瘤胃微生物體外降解不同比例稻秸粉與紫花苜蓿秸稈粉，探索底物有效比例，為人工瘤胃發(fā)酵生產生物蛋白質飼料提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器和試劑

1.1.1 試驗儀器與設備

三角瓶、漏斗、玻璃棒、燒杯若干、容量瓶、量筒、注射器、鑷子、膠頭滴管、濾紙、紗布、溫度計、分析天平（GH-120，日本AND）、GW-06A烘干箱（哈爾濱理化儀器制造廠）、pH酸度計（PT25型，德國塞多利斯公司）、粉碎機(ZN-02，北京興時利和科技發(fā)展有限公司)、水浴鍋（SC-15，上海比朗儀器有限公司）、恒溫箱(DHG-9030，無錫三鑫精工試驗設備有限公司)、雙目顯微鏡（BM311110，北京視界通儀器有限公司）等。

1.1.2 試驗試劑[2]

① 微量元素溶液（A夜）：稱取CaCl2·2H2O 13.2 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，F(xiàn)e-Cl3·6H2O 8.0 g，蒸餾水定容至100 ml。

② 緩沖溶液(B液)：稱取NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g，蒸餾水定容至1 000 ml。

③ 常量元素溶液(C液)：稱取Na2HPO45.7 g,KH2PO46.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，蒸餾水定容至1 000 ml。

④ 還原劑溶液：稱取NaOH 0.16 g，Na2S·9H2O 0.625 g，蒸餾水定容至95 ml。

⑤ 牛瘤胃液：取回瘤胃內容物后，經(jīng)三層紗布過濾，獲得牛瘤胃液并置于39℃恒溫水浴條件下備用。

1.2 試驗材料

1.2.1 紫花苜蓿干草與稻秸的處理

用40目粉碎機將新鮮曬干的紫花苜蓿干草和稻秸粉碎，備用。

1.2.2 動物的選擇

牛是反芻動物，具有瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃四個胃室。在瘤胃中有大量的細菌、原生蟲類和厭氧真菌類，代謝活躍，它們相互協(xié)調作用可以消化和分解飼料中的粗纖維，這是選擇牛的主要原因。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品含水率測定

分別稱取10 g稻秸粉和20 g紫花苜蓿干草置于培養(yǎng)皿中并放入烘干箱內在100℃烘干，烘干后稱量，計算稻秸與紫花苜蓿干草的含水量(見表1)。

表1 烘干樣品前后的重量（g）

1.3.2 樣品分裝（見表2）

表2 稻秸粉和紫花苜蓿干草粉按不同配比稱量數(shù)值（g）

樣品分裝，按重量比例8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8稱取已烘干的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉，再用小藥勺分裝于60 ml三角瓶中，每個三角瓶中干物質總質量為1.4 g，2個空三角瓶備用。

1.3.3 人工瘤胃液的配制

①營養(yǎng)液的配制：蒸餾水400 ml+A液0.1 ml+B液200 ml+C液200 ml+還原劑溶液40 ml，用前新鮮配制，并預熱至39℃。

②人工瘤胃培養(yǎng)液的配制：將牛瘤胃液與培養(yǎng)液按體積比1∶2配比，制成人工瘤胃培養(yǎng)液。

1.3.4 分裝與培養(yǎng)

于佳木斯牛屠宰場取回瘤胃內容物后，經(jīng)三層紗布過濾，獲得牛瘤胃液并置于39℃恒溫水浴條件下備用。取一滴混合均勻的瘤胃液置于載玻片上鏡檢。每個三角瓶中加入45 ml人工瘤胃培養(yǎng)液，成批轉入恒溫箱中培養(yǎng)，開始計時。每隔2 h觀察一次試驗結果，并記錄其產氣量，記錄一次結果之后放空一次所產生的氣體，記錄結果后搖勻，連續(xù)培養(yǎng)36 h。連續(xù)培養(yǎng)36 h后停止試驗記錄，接下來9 h后將三角瓶內的底物取出進行過濾，過濾完畢后，把底物置于120℃下烘干箱內烘干。烘干后稱量，計算干物質降解率[3]。

2 結果

2.1 各時間段的產氣量(見表3)

表3 不同配比秸稈粉在不同時間的發(fā)酵產氣量（ml）

某一時間段培養(yǎng)瓶凈產氣量計算公式：凈產氣量(ml)=某時間段重復試驗組的2個培養(yǎng)瓶平均產氣量(ml)。

2.2 干物質降解率（見表4）

表4 干物質降解率

圖1 不同配比秸稈粉在不同時間的發(fā)酵產氣量

圖2 不同配比秸稈粉的發(fā)酵總產氣量

3 討論

從表3和圖1中可以看出1～8 h產氣速度都比較慢。前6 h產氣量均為0 ml，6～8 h各配比中才陸續(xù)有產氣，但產氣量也不高。這是因為在發(fā)酵初級階段微生物受到好氧雜菌的脅迫作用以至于不能很好的繁殖，隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵罐內的氧氣逐漸耗盡，瘤胃微生物開始繁殖，此時進入正常產氣階段，產氣速度規(guī)律性變快，各組產氣量增加，6～8 h稻秸粉與紫花苜蓿干草粉配比為3∶7和2∶8的產氣量明顯增加。10～12 h樣本配比3∶7和4∶6組產氣量最為明顯，尤其是3∶7組產氣量最多。而試驗進行到14 h時，產氣量普遍減少，而且有上下波動的現(xiàn)象，22 h后產氣速度明顯變慢，30 h后產氣量呈直線下降，這是因為一方面在發(fā)酵過程中產生的代謝產物不能排出，隨著代謝產物的累積，瘤胃微生物反饋受到抑制；一方面可能是發(fā)酵罐內的底物營養(yǎng)漸次消耗，繁殖受阻造成瘤胃厭氧微生物大量死亡，導致產氣量減少。

圖3 干物質降解率

從表4和圖3中可以看出，樣本配比3∶7組干物質降解率最高，發(fā)酵效果最好，4∶6組次之。這是因為紫花苜蓿干草中含有豐富的N元素，是很好的N源，可促進微生物生長，而且3∶7組C/N比最適合微生物生長。其他組由于N源不足，營養(yǎng)不平衡，搭配不合理，使瘤胃微生物不能很好的生長繁殖，干物質降解率降低[4-6]。

4 結論

通過產氣體積和干物質降解率的計算比較，合理的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉配比底物組成為3∶7較好，底物組成為4∶6的次之。因此，3∶7的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉配比是本試驗中最理想的瘤胃微生物體外發(fā)酵比例。試驗也證實了瘤胃微生態(tài)很復雜，進行體外瘤胃微生物發(fā)酵時需要嚴格控制溫度、厭氧、pH值、滲透壓等環(huán)境，同時代謝產物若能夠及時排出以消除反饋抑制，試驗效果將會更明顯。