長白山篤斯越橘菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)生菌的分布特征

苗迎秋，王賀新，李根柱，張自川，湯 莉

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，遼寧 大連 116622）

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）為杜鵑花科越橘屬植物，落葉灌木，果實為藍(lán)紫色小漿果，含有較高的花青素類（Anthocyanins）物質(zhì)，具有較強的抗氧化活性和較高的保健價值[1-2]。在我國篤斯越橘主要分布在大興安嶺北部及小興安嶺和長白山地區(qū)。在長白山地區(qū)，野生篤斯越橘主要生長在海拔700～2 000 m之間的針闊混交林、林溝濕草地、沼澤等地帶，呈塊狀或片狀分布[3]。

菌根是植物根系和真菌所建立的共同體，是植物與微生物所形成的互惠共同體，幾乎普遍存在于所有植物中[4]。一般認(rèn)為，越橘屬植物主要由歐石楠菌根真菌（Ericoid mycorrhiza，ERM）侵染，有時也有叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza，AM）和暗隔內(nèi)生菌根真菌（Dark septate endophytes，DSE）侵染[4-5]。但是，目前國內(nèi)外相關(guān)研究報道僅涉及對篤斯越橘的資源調(diào)查、果實營養(yǎng)價值、樹木生理和開發(fā)利用等方面，而有關(guān)其菌根方面研究鮮有報道。本研究組針對長白山地區(qū)篤斯越橘菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌根真菌的分布特征進行初步觀察，為篤斯越橘菌根生態(tài)學(xué)研究及資源合理開發(fā)和管理提供理論依據(jù)。

1 研究地點與方法

1.1 取樣地點概況

研究地點為長白山自然保護區(qū)東坡和長白山麓的吉林哈泥省級自然保護區(qū)。長白山自然保護區(qū)海拔1 300 m以下的篤斯越橘部分生長在泥炭蘚沼澤草甸子里，部分生長在苔蘚層較厚的落葉松林下。調(diào)查樣地中心點位于42°02′37″N，128°21′36″E，距圓池入口西側(cè)約10 km、邊防公路北約2 km處。群落組成為8落2樺，林分為異齡復(fù)層林，篤斯越橘主要著生于透光度較好的林下或林間空地，呈團狀或片狀分布，郁閉度＞6.0以上的林內(nèi)很少見到團片狀的篤斯越橘灌叢，偶遇少量篤斯越橘卻株型細(xì)弱，生長不良。土壤垂直結(jié)構(gòu)自上而下依次明顯分為4層，最上面第1層為活苔蘚層，相當(dāng)于凋落物層（O層）的L層，其中混有大量新鮮的落葉松凋落物，分解較少；第2層是死苔蘚層，相當(dāng)于凋落物層（O層）的F層，多為半分解的死苔蘚和落葉松凋落物；第3層主要由呈泥炭化的腐殖質(zhì)層（A1層）及其下部少量較薄的淀積層（A2層）組成，此處合并稱為泥炭層（A層），與下層過渡明顯；第4層為火山灰層（C層），由黃白色至棕黃色的火山灰及其顆粒組成。本項目的另一取樣地點為吉林哈泥省級自然保護區(qū)，位于吉林省長白山西側(cè)的龍崗山脈中部。該區(qū)海拔557～1 212 m，屬溫帶濕潤、半濕潤季風(fēng)氣候。調(diào)查樣地中心點位于42°13′27″N，126°29′35″E。兩處采樣地點均為篤斯越橘-落葉松林型，喬木多為長白落葉松（Larix olgensis Henry），伴有白樺（Betula platyphylla）等闊葉樹，下層大灌木有柴樺（Betula fruticosa Pall），小灌木主要有細(xì)葉杜香（Ledum palustre L.）、越橘（Vaccinium vitis-idaea L.）、藍(lán)靛果忍冬（Lonicera edulis Turcz.）和山刺玫（Rosa davurica Pall）等。草本植物大部分是苔草（Carex spp.）和小葉章（Calamagrostis angustifolia Kom.Fern）等。各取樣點的篤斯越橘根系主要生長在枯死苔蘚層和疏松的枯枝落葉層內(nèi)。

1.2 方法

2010年7月于上述區(qū)域隨機對篤斯越橘根部進行取樣，取樣時輕輕去掉根系表面附著的苔蘚枯死殘留物，確保根尖完整，然后取根段在流水下輕輕沖洗干凈，選取不同粗細(xì)的營養(yǎng)根，切成1 cm長小段，用軟化酸處理后固定于FAA固定液中。用下列兩種方法進行觀察。一是石蠟切片法，即將樣根帶回實驗室后經(jīng)脫水、透明、采用常規(guī)石蠟切片法包埋、切片，并用番紅固綠對染和加拿大樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。二是對于纖細(xì)的毛根采用壓片方法直接觀察，即將FAA固定的根段經(jīng)20%KOH透明處理、再經(jīng)2%HCl酸化處理后，用0.02%棉藍(lán)染液染色，直接壓片后用光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 篤斯越橘根形態(tài)結(jié)構(gòu)

調(diào)查顯示，篤斯越橘的根系實際上是由根和根態(tài)莖共同組成，而根系的骨干部分還是以莖為主，莖代行骨干根的功能。真正的根并不發(fā)達(dá)，絕大部分為須根，稀疏地著生在根態(tài)莖上，有少量發(fā)生粗大一些的根，呈不規(guī)則的小彎曲狀，與既有研究一致[5]。成熟毛根非常纖細(xì)（直徑為150 μm以下），次生結(jié)構(gòu)不夠典型。一般周皮由3～4層木栓細(xì)胞組成，其中最外一層呈凋落狀；維管形成層、次生韌皮部和次生木質(zhì)部均不明顯，各占1～2層細(xì)胞；初生木質(zhì)部占有中心很小部分空間（見圖1A）；表面沒有根毛，包裹著1層或疏松或緊密的菌絲層（見圖1B）。直徑為200 μm以上的篤斯越橘根毛根的次生結(jié)構(gòu)較為明顯，周皮細(xì)胞5～6層，排列緊密，胞間隙小，壁木質(zhì)化，最外圍1～2層呈凋落狀，經(jīng)番紅固綠染色后呈紅色；維管形成層和次生韌皮部不明顯，各占1～2層細(xì)胞，而次生木質(zhì)部占有大部分空間（見圖1C）。切片結(jié)果還顯示篤斯越橘初生構(gòu)造中側(cè)根由中柱鞘細(xì)胞產(chǎn)生，對著木質(zhì)部放射角的細(xì)胞分生能力強，發(fā)生分裂，向外突起，形成側(cè)根。在側(cè)根形成過程中，分化出維管組織，并且與主根維管組織連接在一起（見圖1D）。

圖1 篤斯越橘菌根顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Microscopic morphology structure of mycorrhiza of Vaccinium uliginosum

2.2 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的分布

從篤斯越橘根的連續(xù)石蠟切片中可以看到，在已經(jīng)開始次生生長的毛根內(nèi)，內(nèi)生菌根真菌主要侵染根的表皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞（見圖2A、B），含有菌絲體的細(xì)胞壁有150 μm加厚跡象，形成典型的ERM菌絲圈。還發(fā)現(xiàn)在初生構(gòu)造的毛根內(nèi)，有菌根可以侵染到中柱情況，但沒有改變根的基本解剖結(jié)構(gòu)（見圖2C、D）。

圖2 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的分布Fig.2 Distribution of endotrophicmycorrhiza fungi of Vaccinium uliginosum

2.3 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的菌絲形態(tài)

棉藍(lán)染色壓片光鏡觀察結(jié)果顯示，根據(jù)菌絲及菌絲圈的形態(tài)判斷，至少有三種內(nèi)生真菌侵染篤斯越橘根部細(xì)胞。

一種是具有明顯的橫隔膜真菌菌絲能穿破篤斯越橘根表層細(xì)胞壁，并在其中定殖，不斷繁殖，并侵染皮層或周皮的下一層細(xì)胞，形成復(fù)雜濃密的菌絲群，即典型的歐石楠類菌絲復(fù)合體（見圖3A），構(gòu)成篤斯越橘的菌根菌的主體；

另一種是由具有明顯的橫隔膜、呈棕褐色且較粗的真菌菌絲形成的較疏松的暗隔內(nèi)生菌菌絲復(fù)合體（見圖3B），在調(diào)查的篤斯越橘根系中普遍存在；

第三種菌絲是沒有明顯的橫隔膜，但具有典型的二分叉結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞內(nèi)形成泡囊（見圖3C）和叢枝（見圖3D）的泡囊-叢枝菌絲復(fù)合體，在調(diào)查根系中數(shù)量不多但也經(jīng)常出現(xiàn)。

圖3 菌根細(xì)胞內(nèi)菌絲復(fù)合體形態(tài)Fig.3 Morphology of mycelium complex in mycorrhiza cell

3 討論與結(jié)論

3.1 篤斯越橘根的分布及菌根形態(tài)特征

篤斯越橘是東北森林群落的重要組成成分之一，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值，相關(guān)研究很少。研究組在長白山實地觀察結(jié)果顯示，篤斯越橘根系由根狀莖、行莖及其上面著生的細(xì)根和須根構(gòu)成，與分布于北美的同屬矮叢越橘（Vaccinium angustifolium Aiton）相似[6]，但是須根數(shù)量不多，明顯少于矮叢越橘。篤斯越橘根狀莖和須根只生長在有苔蘚枯死體和落葉松等凋落物形成的松軟基質(zhì)內(nèi)，幾乎沒有礦質(zhì)土壤成分[7]。須根在分枝前直徑為50～80 μm，沒有根毛。研究指出菌根對杜鵑花類植物的營養(yǎng)吸收以及增強對逆境因子的抗性等方面具有重要作用[8]，篤斯越橘的菌根是否在某種程度上起到根毛的作用有待于深入研究。

篤斯越橘根的形態(tài)特征表明，在次生構(gòu)造中具有明顯的周皮和次生木質(zhì)部，周皮細(xì)胞呈木栓化，胞內(nèi)空隙較大。維管形成層和次生韌皮部均不明顯，這可能是由于篤斯越橘的毛根過于纖細(xì)，不可能形成太多的細(xì)胞層次有關(guān)（見圖1）。另外，根系橫剖面圖顯示根表皮細(xì)胞脫落、變空，應(yīng)該是根系次生生長產(chǎn)生的木栓保護層及其凋亡外層細(xì)胞。鏡下可見篤斯越橘的根周皮細(xì)胞壁呈現(xiàn)木質(zhì)化加厚，番紅固綠雙重染色后呈紅色，此厚壁細(xì)胞的形成一般被認(rèn)為是植物體的一種防御反應(yīng)，而且切片結(jié)果顯示直徑為50 μm以下的毛根表皮細(xì)胞壁也有呈現(xiàn)木質(zhì)化加厚，有可能是為了適應(yīng)長白山特殊的土壤環(huán)境而形成的一種形態(tài)變化。

越橘屬植物的菌根主要由ERM菌根菌構(gòu)成[4-5,8]，通常在表皮細(xì)胞內(nèi)具有典型的ERM菌絲圈[9]。從圖1B可以看出，在毛根的表面具有一層疏松的菌絲層，這與大多數(shù)杜鵑科植物相同，從圖2A、B，圖3A可以看出，經(jīng)番紅固綠雙重染色后，細(xì)胞內(nèi)含有明顯深色團塊狀結(jié)構(gòu)的就是受到菌絲侵染的細(xì)胞，整個皮層細(xì)胞層受到侵染的細(xì)胞隨機分布，一些根系已經(jīng)在表皮和周皮內(nèi)初步呈現(xiàn)環(huán)狀菌絲圈的特征。一般認(rèn)為，表層細(xì)胞是真菌與植物體相互作用的活躍部位，當(dāng)菌絲侵染到距內(nèi)皮層1～2層細(xì)胞時便停止侵染，也就是說菌絲一般不能侵染內(nèi)皮層及中柱，從而使根仍能保持生活力。但本研究采集的菌根中表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞和中柱都有不同程度內(nèi)生真菌的侵染（見圖2B、C），但沒有改變根的基本解剖結(jié)構(gòu)，這在其他杜鵑花科植物中未見報道。這種現(xiàn)象是偶然的還是普遍存在的現(xiàn)象，對篤斯越橘有無影響等，有待于我們今后詳細(xì)研究確認(rèn)。

3.2 篤斯越橘菌根菌的種類

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長白山野生篤斯越橘菌根菌以歐石楠類菌根菌ERM為主，也有暗隔內(nèi)生菌根真菌DSE和泡囊-叢枝菌根真菌AM感染的現(xiàn)象（見圖3）。有關(guān)杜鵑花科植物菌根研究偏注重于ERM菌根菌，有報道在興安杜鵑菌根形態(tài)特征中發(fā)現(xiàn)除ERM外有少量AM侵染特征[10]，也有利用暗隔內(nèi)生菌根真菌（DSE）接種越橘類植物促進其生長報道[11]。說明3種菌根菌在杜鵑花科及越橘屬植物根系內(nèi)存在。

[1]Lui J,Zhang W,Jing H,et al.Bog bilberry(Vaccinium uliginosum L.)extract reduces cultured Hep-G2,Caco-2 and 3T3-L1 cell viability,affects cell cycle progression and has variable effects on membrane permeability[J].Journal of Food Science,2010,75(3):103-107.

[2]張曉松,孫艷梅,胡振生,等.都柿果酒在釀制過程中總酚和花色苷含量和抗氧化活性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(3):120-124.

[3]郝瑞.長白山篤斯越橘的調(diào)查研究[J].園藝學(xué)報,1979,6(2):87-93.

[4]劉潤進,陳應(yīng)龍.菌根學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2007:1-124.

[5]Monika A G,Sarah H,Hugues B M.Community structure of ericoid mycorrhizas and root-associated fungi of Vaccinium membranaceum across an elevation gradient in the Canadian Rocky Mountains[J].Fungal Ecology,2012,5(1):36-45.

[6]顧姻,賀善安.藍(lán)漿果與蔓越橘[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:17-19.

[7]李根柱,王賀新,陳英敏,等.長白山落葉松林下篤斯越橘群落生物量的空間分布[J].生態(tài)學(xué)雜志,2012,31(6):1404-1410.

[8]張春英,戴思蘭.杜鵑花類菌根研究進展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,30(3):113-119.

[9]Massicotte H B,Melville L H,Peterson R L.Structural characteristics of root-fungal interactions for five ericaceous species in eastern Canada[J].Canadian Journal of Botany,2005,83:1057-1064.

[10]賈銳,楊秀麗,閆偉,等.興安杜鵑菌根形態(tài)特征和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,32(3):63-66.

[11]Vano I,Sakamoto K,Inubushi K.Selection of dark septate endophytes from Ericaceae plants to enhance blueberry(Vaccinium corymbosum L.)seedling growth[C].Abstracts of 7th International Symposium on Integrated Field Science,2009:15.