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    鴨梨過(guò)氧化物酶基因全長(zhǎng)克隆與序列分析

    2013-08-29 09:12:52閆師杰廉雙秋李曉丹朱文嬙
    關(guān)鍵詞:鴨梨過(guò)氧化物克隆

    閆師杰 ,廉雙秋 ,李曉丹 ,李 玲 ,朱文嬙,趙 越*

    (1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系,天津 300384;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)

    鴨梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv.Yali)是我國(guó)白梨品系的優(yōu)良主栽品種,果實(shí)較耐貯藏,采用冷藏方法可以貯藏到第二年2~3月,鴨梨貯藏的主要問(wèn)題是近果心部位組織褐變。閆師杰[1]研究認(rèn)為,鴨梨果心較果肉過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)活性較低,維生素C及GSH含量下降較快,導(dǎo)致果心較果肉更容易積累自由基,發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),最終導(dǎo)致膜透性升高,果心較早褐變。植物過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1.7)的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在植物防御期間發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。整個(gè)植物生命周期POD參與廣泛的生理過(guò)程,可能是由于存在大量的同工酶和多功能酶催化反應(yīng)[4]。一方面植物POD參與生長(zhǎng)素代謝,木質(zhì)素和木栓質(zhì)形成,交聯(lián)細(xì)胞壁成分,植保素的合成,它是一族能催化H2O2、氧化還原無(wú)機(jī)氫供體的酶[5-6];另一方面與植物逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān),例如:POD在病原菌的防御、冷凍、重金屬離子、機(jī)械損傷等因子作用下誘導(dǎo)表達(dá)[7-10],是植物抗氧化保護(hù)酶系的重要保護(hù)酶,是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的生物標(biāo)記之一[11]。目前已從數(shù)百種物種中克隆到POD基因,在GenBank登錄的POD基因序列有1 000多個(gè),而關(guān)于梨屬的僅有2個(gè)片段,且是不完整的POD基因序列,鴨梨完整的POD基因序列及相關(guān)信息還未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)已發(fā)表的梨屬POD基因片段,利用RACE技術(shù)從鴨梨果實(shí)中克隆得到1個(gè)完整的POD基因cDNA。通過(guò)序列分析進(jìn)一步揭示該酶的基因序列信息及表達(dá)特性,為最終調(diào)控植物體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性,抑制果實(shí)酶促褐變奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料、載體和菌株

    以采自河北省藁城的套袋鴨梨為試材,于2011年9月16日采摘,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)梯度降溫后放入冷庫(kù)貯藏。在貯藏期間將鴨梨果實(shí)切成塊狀于液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?寺≥d體pMD18-T Vector購(gòu)于大連寶生物公司,大腸桿菌菌株E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 主要試劑

    M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑、DNA聚合酶、DNA純化回收試劑盒(購(gòu)自索萊寶公司);限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶(購(gòu)自大連寶生物公司);質(zhì)粒小量提取試劑盒(購(gòu)自上海生工);SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(購(gòu)自Clontech公司);其他常規(guī)藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭NA序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)GenBank上FJ478154.1公布的梨屬POD基因的mRNA及CDS信息,用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物POD-F、POD-R,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到該基因的保守片段并測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物PODF1、PODF2用于cDNA的3'RACE擴(kuò)增;設(shè)計(jì)引物PODR1、PODR2用于cDNA的5'RACE擴(kuò)增;最后根據(jù)保守區(qū)、3'RACE、5'RACEcDNA序列的拼接結(jié)果,設(shè)計(jì)引物PODF3、PODR3用于POD基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。

    表1 PCR反應(yīng)中使用的引物Table1 Primers in PCR

    1.2.2 鴨梨POD基因cDNA全長(zhǎng)的獲得

    鴨梨果實(shí)總RNA提取采用CTAB法提取[12],反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū),Oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈,以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板用引物對(duì)POD-F、POD-R進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min,94℃變性35 s,60℃退火35 s,72℃延伸45 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠回收與預(yù)期目的片段大小一致的條帶,電泳檢測(cè)后連接克隆載體(pMD18-T Vector)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)藍(lán)白斑篩選及質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆后,送交測(cè)序。

    根據(jù)克隆所得到的cDNA中間序列分別設(shè)計(jì)特異性引物PODF1、PODF2、PODR1和PODR2,按照RACE試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書(shū)操作,進(jìn)行3'RACE和5'RACEcDNA末端快速擴(kuò)增,將測(cè)序所得的中間序列及3'RACE和5'RACE序列進(jìn)行拼接得到POD cDNA全長(zhǎng)序列,再根據(jù)克隆所得全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物PODF3和PODR3,以5'cDNA為模板,用于擴(kuò)增POD cDNA全長(zhǎng),將該擴(kuò)增產(chǎn)物回收并連入克隆載體后進(jìn)行測(cè)序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鴨梨POD基因的全長(zhǎng)的cDNA的獲得

    根據(jù)鴨梨POD基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物POD-F、POD-R,以鴨梨果實(shí)cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)度為445 bp的cDNA片段(見(jiàn)圖1A)。依據(jù)所得中間序列設(shè)計(jì)特異性引物PODF1、PODF2、PODR1、PODR2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得鴨梨POD基因的3'(見(jiàn)圖1B)和5'(見(jiàn)圖1C)cDNA末端序列,將測(cè)序后的中間片段及3'和5'末端序列拼接得全長(zhǎng)1 487 bp的鴨梨POD基因序列。再根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得基因全長(zhǎng)(見(jiàn)圖1D)。將該基因提交GenBank,基因登錄號(hào)為JQ325052。

    圖1 鴨梨PbPOD基因擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis pattern of PbPOD for Yalipear

    2.2 鴨梨POD基因cDNA核苷酸序列分析

    利用NCBI上提供的ORFFinder對(duì)該序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)鴨梨POD基因包含一個(gè)1 011 bp的編碼區(qū)(CDS);3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)404 bp,含有典型的植物基因加尾信號(hào)序列Poly(A);5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)72 bp,起始密碼子ATG后的第一個(gè)核苷酸為鳥(niǎo)苷酸(G),上述信息表明所克隆到的序列符合完整基因的結(jié)構(gòu)特征,是一個(gè)完整的基因序列。

    2.3 鴨梨過(guò)氧化物酶基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)分析

    2.3.1 過(guò)氧化物酶基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)

    ORFFinder分析表明,該基因的開(kāi)放閱讀框在73~1 083 bp區(qū)域,編碼一個(gè)由336個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,推測(cè)分子質(zhì)量大小為38.4 ku,等電點(diǎn)(pI,Isoelectric point)為8.54,原子總數(shù)為5 386,分子式為C1690H2691N487O499S19,不穩(wěn)定系數(shù)為52.67,其為不穩(wěn)定親水性蛋白。

    蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,PbPOD基因包含8個(gè)半胱氨酸形成4個(gè)二硫鍵,二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋之間由環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主且占56.6%,α-螺旋占41.3%,β-折疊結(jié)構(gòu)很少占2.1%。PbPOD與第Ⅲ類(lèi)植物POD蛋白相比具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似性,可以初步判斷鴨梨POD屬于第Ⅲ類(lèi)植物過(guò)氧化物酶超家族。通過(guò)同源建模法獲得PbPOD的理論三維結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖2(圖2彩版見(jiàn)封二)。POD分子由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成,中間黃色部分為包埋著的血紅素輔基,血紅素平面上方遠(yuǎn)端的“空穴”是H2O2的作用位點(diǎn),它還含有兩個(gè)Ca2+結(jié)合區(qū),一個(gè)Ca2+結(jié)合區(qū)位于近端結(jié)構(gòu)域內(nèi),另一個(gè)位于遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域內(nèi),這在第III類(lèi)POD中是高度保守的。

    圖2 PbPOD蛋白的三級(jí)立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted tertiary structure of the PbPOD

    2.3.2 POD蛋白的功能位點(diǎn)分析

    通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)的保守域檢索及立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具Conserved Domain Database(CDD),發(fā)現(xiàn)POD蛋白具有兩個(gè)保守功能域Cd00693(Secretory peroxidase,分泌性過(guò)氧化物酶)和Cl00196(Plant-peroxidaselike superfamily,植物過(guò)氧化物酶超家族)。進(jìn)一步證明所獲得基因就是鴨梨的過(guò)氧化物酶基因(見(jiàn)圖3,圖3彩版見(jiàn)封二)。

    2.3.3 Pb-POD蛋白的分子進(jìn)化關(guān)系分析

    通過(guò)NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PbPOD編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)該蛋白序列與海欖雌(Avicennia marina)(BAB16317.1)POD有99%的相似性,與陸地棉(Gossypium hirsutum)POD(AAA99868.1)、木欖(Bruguiera gymnorhiza)POD(ADD54644.1)、油茶(Camellia oleifera)POD(ACT21094.1)、長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)(AAY26520.1)、蓮花(Nelumbo nucifera)(ABN46984.1)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)(CAB71128.2)有96%的相似性,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)(CAA17163.1)、文心蘭(Oncidium Gower Ramsey)(ABC02343.1)有95%的相似性,煙草(Nicotiana tabacum)(AAD33072.1)有93%的相似性,甜瓜(Cucumismelo subsp.Melo)(ADN34050.1)有92%的相似性,與多個(gè)物種POD基因所編碼的蛋白序列相似性達(dá)90%以上,確定克隆得到的基因是與鴨梨褐變相關(guān)的POD基因。

    圖3 PbPOD基因編碼的氨基酸序列的預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted amino acid sequenceof PbPOD

    為進(jìn)一步闡明PbPOD與其他植物中POD蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系,使用Clustal X軟件分析各POD蛋白序列之間的相似性,對(duì)包括PbPOD在內(nèi)的植物POD蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析,使用MEGA5軟件構(gòu)建出一個(gè)分子進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖4)。

    圖4結(jié)果顯示,PbPOD與擬南芥的POD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上距離相對(duì)最近,表明它們可能是從同一祖先進(jìn)化而來(lái)。

    圖4 鴨梨PbPOD與其他植物中POD之間的分子進(jìn)化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic evolution analysisbetween PbPOD in Yalipear and other plants

    3 討論與結(jié)論

    本研究利用RT-PCR和RACE方法,從鴨梨果實(shí)中成功克隆出一條完整的過(guò)氧化物酶基因,該基因包含全長(zhǎng)為1 011 bp的編碼區(qū),編碼336個(gè)氨基酸。二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋之間以環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主,其次是α-螺旋,β-折疊結(jié)構(gòu)很少。蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)可以決定蛋白質(zhì)的功能,酶的功能部位常處于這種構(gòu)象區(qū)域;而α-螺旋的主要功能是對(duì)蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定作用。本研究通過(guò)序列分析和氨基酸序列比對(duì)得到的結(jié)果,為進(jìn)一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和生化特性奠定基礎(chǔ)。

    已有研究表明,POD基因與木栓質(zhì)和木質(zhì)素的合成有關(guān),而POD酶被認(rèn)為是抵抗病原侵入的重要防衛(wèi)手段[13-15]。同時(shí),研究表明在植物受到重金屬、低溫等條件的脅迫下,POD蛋白的表達(dá)量也隨之顯著增加[16-17]。但是,基因POD在病原菌防衛(wèi)反應(yīng)和植物抗逆反應(yīng)中的作用還不完全清楚。因此,鴨梨POD基因的克隆為揭示POD結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供較好的研究材料和基礎(chǔ),最終闡明其作用機(jī)理,為鴨梨采后酶促褐變的機(jī)理研究奠定重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

    [1]閆師杰.鴨梨采后果實(shí)褐變的影響因素及發(fā)生機(jī)理的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

    [2]Almagro L,Gomez Ros L V,Belchi-Navarro S,et al.Class III peroxidases in plant defence reactions[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(2):377-390.

    [3]Kumari G J,Reddy A M,Naik ST,et al.Jasmonic acid induced changes in protein pattern,antioxidative enzyme activities and peroxidase isoenzymes in peanut seedlings[J].Biologia Plantarum,2006(50):219-226.

    [4]Passardi F,Cosio C,Penel C,et al.Peroxidases have more functions than a Swiss army knife[J].Plant Cell Reports,2005(24):255-265.

    [5]Passardi F,Zamocky M,Favet J,et al.Phylogenetic distribution of catalase-peroxidases:Arethese patches of order in chaos[J].Gene,2007(397):101-113.

    [6]Bindschedler L V,Dewdney J,Blee K A,et al.Peroxidase dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance[J].The Plant Journal,2006(47):851-863.

    [7]Den H J,Lievens S,Rombauts S,et al.Symbiotic plant peroxidase involved in bacterial invasion of the tropical legume sesbania rostrata[J].Plant Physiology,2007(144):717-727.

    [8]Valrio L,DeMeyer M,Pene L C,et al.Expression analysis of the Arabidopsis peroxidasemultigenic family[J].Phytochemistry,2004,65(10):1331-1342.

    [9]Bae E K,Lee H,Lee JS,et al.Molecular cloning of a peroxidase gene from poplar and its expression in response to stress[J].Tree Physiology,2006,26(11):1405-1412.

    [10]Passardi F,Longet D,Penel C,et al.The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in landplants[J].Phytochemistry,2004,65(13):1879-1893.

    [11]Garc?á-Brugger A,Lamotte O,Vandelle E,et al.Early signaling events induced by elicitors of plant defences[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2006(7):711-724.

    [12]李燕強(qiáng),金志強(qiáng),徐碧玉.香蕉果實(shí)RNA提取方法的改進(jìn)和比較[J].福建熱作科技,2005,50(2):37-43.

    [13]Claudia C,Christophe D.Specific functions of individual class III peroxidase genes[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(2):391-408.

    [14]Choi H W,Kim Y J,Lee SC,et al.Hydrogen peroxide generation by the pepper extracellular peroxidase CaPO2activates local and systemic cell death and defense response to bacterial pathogens[J].Plant Physiology,2007(145):890-904.

    [15]Passardi F,Penel C,Dunand C.Performing the paradoxical:How plant peroxidases modify the cell wall[J].Trends in Plant Science,2004(9):534-540.

    [16]Iraida A,Miguel A B,Mercedes D C,et al.Improved germination under osmotic stress of tobacco plants overexpressing a cell wall peroxidase[J].FEBSLett,1999(457):80-84.

    [17]Chiang H C,Lo JC,Yeh K C.Genes associated with heavy metal tolerance and accumulation in Zn/Cd hyperaccumula tor Arabidopsis halleri:A genomic survey with cDNA microarray[J].Environmental Science and Technology,2006(40):6792-6798.

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