壯骨顆粒對骨折愈合中HIF-1α分泌及骨痂形成影響

王波,萬修陽,陳德喜

(青島大學醫(yī)學院附屬青島市海慈醫(yī)院骨傷科,山東青島 266033)

壯骨顆粒對骨折愈合中HIF-1α分泌及骨痂形成影響

王波,萬修陽,陳德喜

(青島大學醫(yī)學院附屬青島市海慈醫(yī)院骨傷科,山東青島 266033)

目的探討壯骨顆粒對動物模型骨折斷端缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)分泌與骨痂形成的影響。方法32只新西蘭大白兔隨機分成壯骨顆粒組和對照組,各16只。建立兔左前肢橈骨骨折模型,壯骨顆粒組給予壯骨顆粒灌胃治療,對照組給予安慰劑,分別于術(shù)后1、2、4、8周拍X線片,盲法對外骨痂和骨折線進行定量評價;取骨折處骨標本,行免疫組化染色,檢測骨痂組織HIF-1α陽性強度。結(jié)果壯骨顆粒組、對照組外骨痂與骨折線評分隨時間延長逐漸增加,差異有顯著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01);從第2周開始,壯骨顆粒組與對照組外骨痂與骨折線評分比較,差異有顯著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。骨折后第1周兩組均未見HIF-1α陽性染色;骨折2周后,兩組組內(nèi)不同時間比較、兩組間同一時間HIF-1α陽性強度比較,差異均有顯著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。結(jié)論壯骨顆?？纱龠MHIF-1α在骨痂組織中的表達,加速骨痂生成,提高骨痂質(zhì)量。

骨折愈合;骨痂;缺氧誘導因子1;壯骨顆粒

骨折的愈合需要具備三方面的條件:骨折斷端穩(wěn)定的固定、骨折處足夠量具有成骨能力的細胞(包括向成骨及成軟骨方向定向分化的間充質(zhì)細胞及成骨細胞、成軟骨細胞)及骨折斷端豐富的血運[1]。中藥治療骨折有很好的效果。本文在以往研究的基礎(chǔ)上,探討中藥壯骨顆粒對骨折的治療作用及其機制,以更好地指導臨床。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康新西蘭大白兔32只,10月齡,雌雄各半,體質(zhì)量2.0～2.2 kg。壯骨顆粒(組方:補骨脂、淫羊藿、山茱萸、煅狗骨、黨參、補骨脂、自然銅等,原藥材購自青島市醫(yī)藥公司),青島市海慈醫(yī)療集團制劑室加工制備,每克顆粒含原生藥2.9 g。

1.2 實驗方法

新西蘭大白兔隨機分為壯骨顆粒組和對照組,每組16只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后均制備左側(cè)橈骨中段骨折模型。骨折模型制備方法:兔前肢脫毛,耳緣靜脈進行麻醉;常規(guī)消毒,鋪巾,取前肢下段內(nèi)側(cè)約4 cm切口,常規(guī)切開皮膚,暴露橈骨,在橈骨旋前圓肌止點遠端,用線鋸造成3 mm的骨缺損[2]。沖洗,縫合皮層,骨折不固定,清潔紗布包扎傷口。術(shù)后每只兔均肌肉注射青霉素40萬單位,連續(xù)注射3 d。分籠飼養(yǎng),注意清潔衛(wèi)生。壯骨顆粒組給予壯骨顆粒0.5 g/kg(生藥)灌胃,每天3次;對照組給予安慰劑,劑量用法同壯骨顆粒組。

1.3 檢測指標及方法

術(shù)后1、2、4、8周,隨機從兩組中各選4只大白兔進行X線攝片,采用盲法對外骨痂和骨折線進行定量評價[2-3];然后將兔處死,從骨折處取長度為1 cm的骨標本(保留骨膜組織),置于40 g/L的多聚甲醛溶液中4℃環(huán)境下固定48 h,再放入150 g/ L的EDTA溶液中脫鈣2周,3 d更換脫鈣液1次。脫鈣后,經(jīng)梯度乙醇逐級脫水后,石蠟縱向包埋,切片,厚度5μm,行免疫組化染色。顯微鏡下(100倍)觀察,每個標本取5張切片,每張切片隨機取5個視野,測定HIF-1α陽性強度,取其均值。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料結(jié)果用±s表示,數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外骨痂與骨折線評分比較

第1周壯骨顆粒組骨痂沒有形成,骨小梁不明顯;對照組大量的纖維組織增生,少量骨痂生成。第2周開始,壯骨顆粒組與對照組開始出現(xiàn)骨痂。第4周,壯骨顆粒組骨痂量明顯增多,部分動物骨折斷端被骨痂完全充填。第8周壯骨顆粒組骨折斷端骨折線消失,骨膜反應(yīng)明顯;對照組骨折斷端模糊,骨膜反應(yīng)密度淺淡,骨痂量少。壯骨顆粒組、對照組外骨痂與骨折線評分隨時間延長逐漸增加,差異有顯著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01)。從第2周開始,壯骨顆粒組與對照組外骨痂和骨折線評分比較,差異有顯著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組HIF-1α陽性強度比較

骨折后第1周兩組均未見HIF-1α陽性染色;骨折后2周,壯骨顆粒組與對照組骨折斷端、骨外膜下及周圍軟組織形成的血腫內(nèi)有大量的細胞增殖分化,這些細胞間質(zhì)中HIF-1α染色陽性;骨折后4周,骨痂中成骨細胞著色較深,壯骨顆粒組較對照組HIF-1α陽性表達數(shù)目多;骨折后8周,兩組中成骨細胞成熟,骨小梁周圍HIF-1α表達較弱。兩組組內(nèi)不同時間比較、兩組間同一時間比較,HIF-1α陽性強度差異有顯著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。見表2。

3 討 論

近年來出現(xiàn)了許多可以促進骨折愈合的方法,其機制為促進細胞活性、促進骨痂生成、調(diào)節(jié)骨細胞基因序列的表達、干預骨生長因子的生成等[4-7]。中藥可在骨折愈合不同時期發(fā)揮修復作用[2]。壯骨顆粒以中醫(yī)“腎主骨”、“補先后天”理論為原則組方而成,主要由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、補骨脂及自然銅等藥組成。現(xiàn)代研究表明,按骨折愈合過程,在血腫機化期,煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、補骨脂等活血化瘀藥可以促進微循環(huán)代謝,增加骨折斷端局部血運,清除血凝塊及代謝產(chǎn)物,起到消腫止痛、促進骨細胞生成作用[8-9]。

表1 兩組不同時間外骨痂與骨折線評分比較(n＝4,±s)

__組__別______1周2周4周8周對 照 組0.835±0.754 6.551±1.047 18.505±1.374 25.785±1.023壯骨顆粒組2.831±0.980 9.168±1.169 21.335±2.064 35.465±1.564

表2 兩組術(shù)后不同時間骨痂標本中HIF-1α陽性強度比較(n＝20,±s)

____組__別___________________________________________________ ________2周4周8周對 照 組2.67±0.23 3.12±0.37 2.01±0.05 __壯骨顆粒組____3.56±0.09____4.23±0.6____________________ 7 2.11±0.07

HIF-1是體內(nèi)細胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種結(jié)合DNA蛋白質(zhì)因子,參與對低氧反應(yīng)基因的調(diào)控,從而使人體對低氧刺激作出復雜的病理生理反應(yīng)。已有研究表明,低氧-HIFα通路調(diào)節(jié)骨發(fā)育與骨形成過程,在骨和關(guān)節(jié)形成、發(fā)育進程中,HIF-1α表達具有與骨生長進程相關(guān)聯(lián)的顯著時空特征[10-13]。

本文結(jié)果顯示,骨折2周后,壯骨顆粒組與對照組組內(nèi)不同時間比較、兩組間同一時間比較,HIF-1α陽性強度差異均有顯著性。提示壯骨顆粒可促進兔骨折愈合并促進成骨活躍,提高骨折的愈合質(zhì)量。其作用機制可能與調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)因子、促進骨折局部骨痂形成,調(diào)節(jié)血清微量元素等有關(guān)。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THE EFFECT OF ZHUANGGU GRANULA ON SECRETION OF HIF-1αAND CALLUS FORMATION IN FRACTURE HEALING

WANG Bo,WAN Xiuyang,CHEN Dexi (Department of Orthopedics,Qingdao Hiser Hospital,Qingdao 266033,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Zhuanggu granula on secretion of HIF-1αand callus formation in animal model with fracture.MethodsA total of 32 New Zealand rabbits were equally randomized to two groups.A model of left radius fracture was created in rabbits.Intragastric administration of Zhunggu granula was given to rabbits in the Zhunggu granula group,and to those in the control,placebo was offered.X-ray films were taken 1,2,4 and 8 weeks after surgery.The blind method was used to quantitatively assess external callus and fracture line.Bone samples from the fractured part were taken and stained by immunohistochemisty to determine positive HIF-1αin bony callus.ResultsThe score of external callus and fracture line in both groups was increased along with the extension of duration,the different was significant.The differences of scores of external callus and fracture line between Zhuanggu granula and control group were significant beginning from the second week(F＝6.51－134.14,P＜0.05).No positive staining of HIF-1αwas found on the first week of fracture;after two weeks,the positive expression of HIF-1αof different time points in the same group,and that of the same time point between the two groups were significant(F＝6.76－64.93,P＜0.05).ConclusionZhuanggu granula can promote the secretion of HIF-1αin bone callus,and accelerate its formation and raise its quality.

fracture healing;bony callus;hypoxia-inducible factor 1;Zhuanggu granula

R683.41

A

1008-0341(2013)04-0359-03

10.11712/qlyx201304026

2013-01-04;

2013-06-06

青島市科技發(fā)展計劃(07-2-1-20-nsh)

王波(1979-),男,在讀碩士研究生。

陳德喜(1959-),男,教授,碩士生導師。