單核細(xì)胞趨化蛋白-1及其受體與子癇前期發(fā)病關(guān)系

張金春,左建新,彭偉,葉元華

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科,山東青島 266003)

單核細(xì)胞趨化蛋白-1及其受體與子癇前期發(fā)病關(guān)系

張金春,左建新,彭偉,葉元華

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科,山東青島 266003)

目的探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及其受體(CCR2)與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法選擇在我院住院分娩的子癇前期孕婦60例,其中重度子癇前期30例,輕度子癇前期30例,以同期分娩的正常晚期妊娠孕婦30例為對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測兩組孕婦血清MCP-1濃度,采用實時PCR技術(shù)檢測兩組孕婦胎盤組織中MCP-1及CCR2 m RNA表達(dá)水平。結(jié)果子癇前期組孕婦血清MCP-1濃度顯著高于對照組(t＝3.4,P＜0.05),輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。子癇前期組孕婦胎盤組織中CCR2 m RNA的表達(dá)顯著高于對照組(t＝6.1,P＜0.05),輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。子癇前期組孕婦胎盤組織中MCP-1 m RNA的表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論孕婦血清中MCP-1及胎盤組織CCR2 m RNA的表達(dá)與子癇前期發(fā)病密切相關(guān),但與疾病嚴(yán)重程度無明顯關(guān)系。

先兆子癇;趨化因子CCL2;受體,CCR2

子癇前期是孕婦妊娠期所特有的疾病,是導(dǎo)致妊娠婦女和圍生兒患病率及死亡率增高的主要原因之一。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,子癇前期的主要發(fā)病機(jī)制是胎盤淺著床和血管內(nèi)皮受損[1-2]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是1989年首先在人膠質(zhì)細(xì)胞瘤單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)和提純的重要趨化因子。研究結(jié)果表明,MCP-1可通過與其受體CCR2結(jié)合,介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)的發(fā)生,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前,對于MCP-1及其受體在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。本研究通過測定MCP-1及其受體在子癇前期孕婦血清及胎盤組織中的表達(dá)情況,探討其與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇在我院住院分娩的子癇前期孕婦60例,其中重度子癇前期30例,輕度子癇前期30例,輕度及重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》。以同期分娩的正常晚期妊娠孕婦30例為對照組。兩組孕婦年齡及孕周比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。兩組妊娠均為單胎,既往無全身炎癥、原發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病及慢性腎炎等病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有孕婦均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 于分娩前24 h空腹采集兩組孕婦肘靜脈血5 m L,分離血清后于－80℃冰箱保存。胎盤娩出后即刻,在無菌狀態(tài)下于胎盤的母體面中間避開梗死及鈣化區(qū)取胎盤組織約2 cm×2 cm× 2 cm大小,用無菌生理鹽水充分漂洗后,再用無菌紗布吸掉水分,置于1.5 m L無菌EP管中－80℃冰箱保存,以待RNA的提取。

表1 兩組孕婦年齡及孕周比較(±s)

___組別_________n年齡(歲)孕周(周)對照組30 28.7±2.2 39.2±1.1子癇前期組60 32.4±4.5 36.1±2.2輕度30 32.2±5.5 36.8±2.1 ___重度_________30___________________________________________ 32.3±2.6 34.6±2.3

1.2.2 血清MCP-1濃度檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法,試劑購自青島威思科德商貿(mào)有限公司,所有標(biāo)本同批測定,批內(nèi)變異＜6%。

1.2.3 胎盤組織MCP-1及CCR2 m RNA的表達(dá)檢測 采用實時PCR技術(shù)。取胎盤組織約100 mg,經(jīng)充分研磨后采用Trizol-氯仿一步法提取胎盤組織的總RNA,取3μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。試劑盒由日本TAKARA公司提供,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR引物序列見表2。建立20μL PCR反應(yīng)體系:primixe酶10μL,上下游引物各2μL,超純水5μL,cDNA產(chǎn)物1μL。MCP-1擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,57℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。CCR2擴(kuò)增條件除退火溫度為62℃外,余均相同。GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)條件:98℃10 s,58℃30 s,72℃20 s,72℃延伸10 min,共35個循環(huán)。以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,取目標(biāo)產(chǎn)物2μL電泳30 min,電泳結(jié)果用計算機(jī)掃描分析,以MCP-1或CCR2擴(kuò)增條帶實際灰度值與GAPDH的實際灰度值的比值表示MCP-1或CCR2 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦血清及胎盤組織中MCP-1和CCR2表達(dá)比較

子癇前期組血清MCP-1濃度與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝3.4,P＜0.05);輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

子癇前期組胎盤組織中MCP-1 m RNA的表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。子癇前期組胎盤組織中CCR2 m RNA的表達(dá)水平顯著高于對照組(t＝6.1,P＜0.05);輕度子癇前期組與重度子癇前期組相比較,差異無顯著意義(P＞0.05)。見表3及圖1、2。

2.2 子癇前期孕婦血清與胎盤組織中MCP-1表達(dá)的相關(guān)性

子癇前期孕婦血清MCP-1表達(dá)水平與其胎盤組織MCP-1 m RNA表達(dá)水平無相關(guān)性(r＝0.077, P＞0.05)。

3 討 論

MCP-1基因啟動子上有與NF-k B結(jié)合位點,結(jié)合后可激活MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄。MCP-1的特異性受體CCR2屬7次跨膜α螺旋受體,在多種細(xì)胞上表達(dá),包括單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。MCP-1可由多種細(xì)胞分泌,屬炎癥反應(yīng)的始發(fā)因子,其與CCR2結(jié)合后,受體與G蛋白相互作用,激活細(xì)胞內(nèi)第二信使,產(chǎn)生酶或功能蛋白,進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng),招募單核-巨噬細(xì)胞到特定部位,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4-5]。

3.1 MCP-1在子癇前期孕婦血清中的表達(dá)及意義

MCP-1在炎癥、動脈硬化、妊娠免疫失衡、高血壓、腦脊髓炎、腫瘤等病理過程中發(fā)揮重要的作用。但關(guān)于MCP-1與孕婦子癇前期發(fā)病的關(guān)系尚未明確。已有研究顯示,MCP-1在子癇前期孕婦血清中表達(dá)明顯升高,MCP-1可能在子癇前期孕婦中引起了全身過度的炎癥反應(yīng),并且參與免疫細(xì)胞Th1與Th2的轉(zhuǎn)變,母胎界面趨化因子MCP-1在可控制狀態(tài)下參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的入侵,推測一旦MCP-1表達(dá)升高,將導(dǎo)致滋養(yǎng)層入侵障礙引起胎盤低氧,釋放炎性因子,導(dǎo)致子癇前期的發(fā)病[6-7]。MOLVAREC等[8-9]采用基因懸浮芯片技術(shù)檢測子癇前期孕婦與正常足月孕婦血清中MCP-1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦高表達(dá)MCP-1,指出子癇前期發(fā)病可能與過度的全身炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,子癇前期孕婦血清中MCP-1表達(dá)明顯高于正常孕婦。推測MCP-1募集單核-巨噬細(xì)胞,進(jìn)而引發(fā)全身其他炎性遞質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放,導(dǎo)致全身炎癥免疫反應(yīng)的發(fā)生,損傷血管內(nèi)皮,引起子癇前期發(fā)病。本研究子癇前期孕婦血清中MCP-1的表達(dá)與疾病的輕重程度之間暫未顯示有明顯關(guān)系,需進(jìn)一步研究探討。

表3 兩組孕婦血清及胎盤組織中MCP-1和CCR2表達(dá)比較(±s)

與對照組比較,?t＝3.4、6.1,P＜0.05。

組別n__血清MCP-1 (ρ/ng·L－1)_MCP-1 mRNA CCR2 m RNA對照組30 186.9±77.8 3.0±2.3 2.3±0.5子癇前期組60 263.5±85.0?2.8±2.8 3.1±0.6?輕度30 247.3±114.5 3.2±3.1 2.9±0.4 __重度______30__279.7±34.2_____________________________ 2.4±2.5 3.2±0.4

3.2 CCR2 m RNA在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)及意義

MAYA等[10]建立CCR2模型小鼠,采用一定濃度CCR2拮抗劑可抑制單核-巨噬細(xì)胞聚集,進(jìn)而抑制血管炎癥反應(yīng),減輕血管內(nèi)皮損傷。蘇林丘等[11]采用實時PCR技術(shù)檢測冠心病病人單核細(xì)胞CCR2受體表達(dá),結(jié)果顯示其與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,而且隨病情進(jìn)展而表達(dá)升高, CCR2表達(dá)升高招募大量單核-巨噬細(xì)胞,損傷血管內(nèi)皮。子癇前期孕婦存在過度的炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮受損[8,12]。本文的研究結(jié)果顯示,子癇前期孕婦胎盤組織CCR2 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常孕婦, CCR2主要由炎癥細(xì)胞分泌產(chǎn)生,推測在子癇前期發(fā)病時CCR2招募大量單核-巨噬細(xì)胞到達(dá)胎盤局部,導(dǎo)致炎性遞質(zhì)及細(xì)胞因子釋放,引起孕婦胎盤組織的炎癥免疫反應(yīng),對胎盤組織及血管造成一定的損傷。

3.3 MCP-1 m RNA在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)及意義

目前對子癇前期胎盤組織中MCP-1 m RNA研究報道較少。JONG等[13]采用實時PCR技術(shù)和Western blot分析研究結(jié)果顯示,子癇前期孕婦胎盤衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞MCP-1 m RNA的表達(dá)與正常孕婦胎盤組織比較無顯著差異。本研究顯示,子癇前期孕婦胎盤組織中MCP-1 m RNA表達(dá)與對照組比較無顯著差異,而且胎盤組織MCP-1 m RNA表達(dá)與血清MCP-1濃度無相關(guān)性,證明子癇前期孕婦血清中MCP-1的產(chǎn)生與胎盤組織MCP-1基因的表達(dá)無明顯關(guān)系,考慮MCP-1的產(chǎn)生并不來源于胎盤組織,但孕婦血清中MCP-1可進(jìn)入胎盤組織招募單核細(xì)胞聚集,引起胎盤組織炎癥反應(yīng),同時導(dǎo)致胎盤組織中CCR2 mRNA表達(dá)增高。MCP-1與胎盤組織中的特異性受體CCR2結(jié)合,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),損傷血管內(nèi)皮,引起子癇前期發(fā)病。

綜上所述,子癇前期病人血清中MCP-1和胎盤組織中CCR2表達(dá)升高,可能通過炎癥免疫機(jī)制引起子癇前期發(fā)病,但是其與子癇前期嚴(yán)重程度的相關(guān)性需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 馬偉平)

RELATIONSHIP BETWEEN MCP-1,ITS RECEPTOR AND PREECLAMPSIA

ZHANG Jinchun,ZUO Jianxin,PENG Wei, YE Yuanhua (Department of Obstetrics,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo study the association of monocyte chemotactic protein-l(MCP-1)and its receptor(CCR2)with preeclampsia.MethodsSixty women with preeclampsia(30 severe and 30 mild)who gave birth in our hospital were selected, and 30 late pregnant women who gave birth in the same time period were served as controls.ELISA was used to measure the levels of serum MCP-1.The expressions of MCP-1 massager RNA(m RNA)and CCR2 m RNA in placenta tissue were determined by RTPCR.ResultsIn preeclampsia group,the serum concentration of MCP-1 was significantly higher than the control(t＝3.4,P＜0.05),No significant difference was found in the expression of MCP-1 between severe and mild preeclampsia group(P＞0.05).CCR2 m RNA expression in placenta in preeclampsia group was significantly higher than the control(t＝6.1,P＜0.05),bur that between severe and mild preeclampsia group was not statistically significant(P＞0.05).No significant difference was found in the expressions of MCP-1 m RNA in placenta between preeclampsia and control group(P＞0.05).ConclusionThe expression levels of MCP-1 in serum and CCR2 m RNA in placenta were closely related to the occurrence of preeclampsia,but not with the severity of the illness.

pre-eclampsia;chemokine CCL2;receptors,CCR2

R714.25

A

1008-0341(2013)04-0331-04

10.11712/qlyx201304016

2012-12-18;

2013-04-22

張金春(1985-),女,碩士研究生。

葉元華(1963-),男,博士,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師。