CTLA-4基因CT60位點基因多態(tài)性與小兒急性淋巴細胞白血病相關(guān)性

曾鵬,王一冰,劉華林

(1 青島大學醫(yī)學院兒科學教研室,山東青島 266071; 2 青島市婦女兒童醫(yī)院血液腎臟科)

CTLA-4基因CT60位點基因多態(tài)性與小兒急性淋巴細胞白血病相關(guān)性

曾鵬1,王一冰1,劉華林2

(1 青島大學醫(yī)學院兒科學教研室,山東青島 266071; 2 青島市婦女兒童醫(yī)院血液腎臟科)

目的探討CTLA-4基因CT60位點多態(tài)性與小兒B系急性淋巴細胞白血病(ALL)的關(guān)系。方法選取86例B系A(chǔ)LL病兒和112例正常對照者,分別留取外周血標本,提取基因組DNA,聚合酶鏈式反應及產(chǎn)物直接測序方法檢測CT60位點基因型,比較兩組以及病例組不同性別、不同臨床危險度病兒基因型頻率及等位基因頻率的差異。結(jié)果病例組CT60位點AA和AG基因型頻率顯著低于對照組(χ2＝6.365,P＜0.05),A等位基因頻率亦明顯低于對照組(χ2＝6.761,P＜0.05);CT60位點基因型及等位基因頻率分布與B系A(chǔ)LL病兒性別及臨床危險度無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論CTLA-4基因CT60位點基因多態(tài)性與小兒B系A(chǔ)LL易感性存在相關(guān)性。

白血病,淋巴細胞,急性;基因,CTLA-4;多態(tài)性,單核苷酸

急性淋巴細胞白血病(ALL)是兒童時期最常見的腫瘤,發(fā)病率約(3～4)/10萬,其病因及發(fā)病機制目前尚不明了,一般認為多因素參與致病,其中免疫監(jiān)視功能異常可能是因素之一。CTLA-4是T細胞活化中一種重要的負性調(diào)節(jié)蛋白,可以通過降低T細胞活化抑制人體抗腫瘤免疫反應。本文通過研究CTLA-4基因CT60位點多態(tài)性與兒童B系A(chǔ)LL的相關(guān)性,探討兒童ALL遺傳易感性,了解其免疫學發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年3－9月,選取青島市婦女兒童醫(yī)院及青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液兒科收治86例B系A(chǔ)LL病兒作為病例組,男54例,女47例,年齡1～14歲,平均年齡(5.60±3.02)歲;標危型54例,高危型32例。對照組112例為青島市婦女兒童醫(yī)院兒童保健科健康體檢兒童,男50例,女62例,年齡1～14歲,平均年齡(6.30±2.76)歲,排除其他腫瘤性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病,近半年無重大感染性疾病,無糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑用藥史。全部研究對象均無血緣關(guān)系。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 采集空腹靜脈血2 m L,EDTA抗凝,使用提取試劑盒(中國天根公司生產(chǎn))提取DNA,用k5500微量分光光度計測DNA的吸光度(A)值及濃度,A值介于1.8～2.0之間說明純度較高,符合標準,調(diào)整DNA濃度至10～100 mg/L,于－20℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR) 參考已發(fā)表文獻的CTLA-4基因核酸序列(Gene ID:1493),委托上海Majorbio公司設(shè)計并合成引物。上游引物F:5′-GCTTCATGAGTCAGCTTTGC-3′,下游引物R: 5′-CTGTGTTAAACAGCATGCCA-3′。超純水溶解引物,使其終濃度為5μmol/L。PCR反應體系: Premix Ex Taq(大連TAKARA公司生產(chǎn))25μL,上下游引物各2μL,DNA 7.5μL,使用超純水補足50μL。反應條件:95℃預變性5 min;98℃變性5 s,62℃退火30 s,72℃延伸10 s,共35個循環(huán); 72℃后延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物鑒定和測序 取產(chǎn)物5μL加上樣緩沖液1μL,于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳中檢測PCR產(chǎn)物,在凝膠成像儀下觀察結(jié)果并攝影,取電泳條帶較亮者委托上海Majorbio公司采取Sanger法常規(guī)測序。將測序所得核酸序列與BLAST比對,用ChromasPro軟件分析測序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。直接計數(shù)法計算基因型和等位基因頻率,Hardy-Weinberg平衡檢驗及組間比較采用χ2檢驗。以AA基因型或A等位基因為暴露因素,采用比數(shù)比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)評價疾病與基因的關(guān)聯(lián)強度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳平衡

經(jīng)χ2檢驗,對照組符合Hardy-Weinberg平衡,具有群體代表性。

2.2 CTLA-4基因CT60位點基因型判定

PCR擴增產(chǎn)物長為161 bp,測序得3種基因型,分別為AA、AG和GG。見圖1～4。

2.3 兩組CTLA-4基因CT60位點基因型及等位基因頻率分布

CTLA-4基因CT60位點基因型及等位基因頻率在兩組的分布差異均有統(tǒng)計學意義(χ2＝6.365、6.761,P＜0.05)。與對照組相比,病例組AA和AG基因型明顯減少,而GG基因型比例增加。以AA基因型為基準,AG和GG基因型的OR值分別為1.176和2.590。病例組攜帶G等位基因明顯增多,以A等位基因頻率為基準,G等位基因的OR值為2.066。見表1。

2.4 病例組不同性別之間CTLA-4基因CT60位點基因型及等位基因頻率分布

與女性病兒相比較,男性病兒CTLA-4基因CT60位點AA和GG基因型減少,A等位基因頻率降低,但差異無顯著意義(P＞0.05)。因例數(shù)太少,故將AA和AG基因型合并分析。以AA＋AG基因型的總和為基準,GG基因型的OR值為1.898;以A等位基因頻率為基準,G等位基因的OR值為1.537,差異均無顯著意義(P＞0.05)。見表2。

2.5 病例組不同臨床危險度之間CTLA-4基因CT60位點基因型及等位基因頻率分布

與低危病兒相比較,高危病兒CTLA-4基因CT60位點AA和GG基因型增多,A等位基因頻率升高,但差異無顯著性(P＞0.05)。因例數(shù)太少,亦將AA和AG基因型合并分析。以AA＋AG基因型的總和為基準,GG基因型的OR值為0.485;以A等位基因頻率為基準,G等位基因的OR值為0.452,差異均無顯著性(P＞0.05)。見表3。

3 討 論

急性白血病是高度異質(zhì)性的造血組織的惡性疾病,其病因尚未完全明了,可能與病毒因素、理化因素及遺傳易感性相關(guān)。近年來,對免疫相關(guān)遺傳機制的研究,尤其是免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的研究有可能揭示自身免疫性疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制。免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的多態(tài)性可能影響個體之間免疫應答反應以及疾病易感性的不同。如IL-18、IL-10、TGF基因多態(tài)性分別與原發(fā)性干燥綜合征、胃竇癌及結(jié)直腸癌患病風險相關(guān)[1-3]。

CTLA-4基因是免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因之一。該基因表達于活化的T細胞表面,可與相應配體結(jié)合后傳遞負性反饋信號發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CTLA-4在T細胞應答的不同階段都發(fā)揮了重要作用,包括調(diào)節(jié)T細胞活化閾值,抑制T細胞增殖和誘導活化T細胞凋亡[4]。與同源的CD28分子不同,CTLA-4能夠傳遞抑制性信號,抑制T細胞的活化增殖,抑制免疫反應,有可能誘導外周免疫耐受。由此可以推斷,阻斷CTLA-4可以增強免疫應答,已有動物實驗報道其與腫瘤疫苗聯(lián)用可以治愈荷瘤小鼠[5]。CTLA-4已經(jīng)被視為抑制抗腫瘤免疫的重要調(diào)節(jié)因子。CTLA-4的基因多態(tài)性可影響其表達水平,由此可以推測,其基因多態(tài)性可能影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究已經(jīng)報道了一些CTLA-4的多態(tài)性位點,其中的＋49A/G、－318C/T、－1661A/G、－1722T/C等多態(tài)性位點,分別與胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳癌等疾病相關(guān)[6-9]。

CT60位點是最近發(fā)現(xiàn)的一個多態(tài)性位點,李恒等[9]的研究結(jié)果顯示,中國北方漢族女性乳癌病人CT60位點G等位基因頻率明顯高于正常對照組。本研究探討了CT60位點與中國兒童B系A(chǔ)LL的關(guān)聯(lián)性,病兒GG基因型和G等位基因頻率較對照組明顯升高,而這種差異同性別及臨床危險度無關(guān)。這與李恒等[9]的研究一致,提示CTLA-4基因有可能是人類多種腫瘤的共同易感基因之一。與在中國人群中的研究結(jié)果不一致。COZAR等[10]的研究顯示,西班牙人群中腎細胞癌病人CT60位點的AA基因型頻率較高,但在結(jié)腸癌中并沒有明顯的相關(guān)性。在不同人種的不同腫瘤性疾病中該多態(tài)性位點可能發(fā)揮著不同的作用,具體機制尚不明確。UEDA等[11]研究顯示,CT60位點G等位基因與可溶性CTLA-4(sCTLA-4)表達減少相關(guān),CT60位點決定了剪接作用的效率及sCTLA-4的m RNA產(chǎn)量,從而決定了sCTLA-4相對于全長CTLA-4的量,尤其是純合子中GG基因型個體相對于AA基因型個體,sCTLA-4產(chǎn)量降低。本文中病兒CT60位點G等位基因頻率較對照組明顯升高,由此推測病兒sCTLA-4水平可能下降。未激活的T細胞常規(guī)產(chǎn)生sCTLA-4,而活化后產(chǎn)量降低。通常認為膜表面蛋白的可溶形式與其競爭性結(jié)合配體而發(fā)揮抑制作用[12]。sCTLA-4的水平降低,相對加強了B7-mCTLA4的相互作用,誘導了T細胞無能,從而抑制了T細胞活化?？梢赃M一步研究病兒外周sCTLA-4的表達,從而闡明免疫機制在小兒白血病發(fā)病中的作用。

總之,本研究表明,CTLA-4基因CT60位點基因多態(tài)性與中國小兒B系A(chǔ)LL存在一定相關(guān)性,但此位點的具體作用機制是否是通過影響sCTLA-4的表達而發(fā)揮作用需要進一步的研究。此外,易普利姆瑪(Ipilimumab),一種阻斷CTLA-4的單克隆抗體,已被FDA批準用于治療晚期黑色素瘤,此藥能否作為一種靶向治療藥物用于難治性白血病需要進一步的探討。

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(本文編輯 馬偉平)

ASSOCIATION OF CYTOTOXIC T LYMPHOCYTE ANTIGEN-4 CT60 GENE POLYMORPHISM WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA IN CHILDREN

ZENG Peng,WANG Yibing,LIU Hualin (Major of Pediatrics,Qingdao University Medical College,Qingdao 266071,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen-4(CTLA-4)CT60 gene polymorphism and children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).MethodsA total of 86 children with ALL and 112 healthy controls was selected.Their genomic DNA was extracted from peripheral blood samples.The genotype was determined by polymerase chain reaction(PCR)and PCR product sequencing.Genotype and alleles frequency were compared between the two groups.ResultsThe frequency of AA and AG genotype was significantly lower in the patients than the controls(χ2＝6.365, P＜0.05),and so did A allele gene(χ2＝6.761,P＜0.05).This kind of difference was not associated with sex and clinical risk.ConclusionCTLA-4 CT60 gene polymorphism is associated with susceptibility to ALL in children.

leukemia,lymphocytic,acute;genes,CTLA-4;polymorphism,single nucleotide

R725.5

A

1008-0341(2013)04-0310-04

10.11712/qlyx201304010

2013-01-23;

2013-05-10

曾鵬(1987-),女,在讀碩士研究生。

劉華林(1958-),女,主任醫(yī)師,碩士生導師。