高通量測序技術(shù)的發(fā)展及其在畜禽上的應(yīng)用

曹 婷，張立嶺，侯冠彧，周漢林，施力光，荀文娟

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.海南大學(xué) 農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570228)

高通量測序技術(shù)主要分為：離子半導(dǎo)體測序、大規(guī)模平行簽名測序、Illumina (Solexa) sequencing、454焦磷酸測序、ABI SOLiD sequencing、聚合酶克隆、DNA納米球測序等。目前的高通量測序技術(shù)主要指454 Life Sciences公司、ABI公司和Illumina公司推出的第二代測序技術(shù)、單分子測序技術(shù)以及Ion Personal Genome Machine (PGMTM)新一代測序技術(shù)(第三代測序技術(shù))[1-7]。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，為更深入研究和探討基因組或者目的基因的作用機(jī)制和功能帶來了巨大的應(yīng)用價(jià)值。

1 高通量測序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 第二代測序技術(shù)(下一代高通量技術(shù))

454 Life Sciences公司在2005年首次開發(fā)出了了第二代測序技術(shù)，根據(jù)酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)原理研發(fā)出基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)[8]。接下來，Illumina公司和ABI公司相繼推出Solexa[9-12]及SOLiD[13]測序技術(shù)。這些測序技術(shù)都是邊合成邊測序，即都是在合成鏈互補(bǔ)時(shí)加入被熒光標(biāo)記的堿基獲知加入的堿基被酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，通過捕獲被激發(fā)或者自身的光信號轉(zhuǎn)化的峰值，獲得序列信息。高通量測序技術(shù)操作簡單，徹底脫離了傳統(tǒng)測序技術(shù)中電泳的限制和束縛。與此同時(shí)，高通量分析也可以在芯片上進(jìn)行。高通量測序技術(shù)可以一次同時(shí)測序和分析數(shù)以百萬計(jì)的樣品，這是傳統(tǒng)的測序技術(shù)遠(yuǎn)不能及的，很大程度上節(jié)省了試驗(yàn)的時(shí)間和成本。

Roche/454測序技術(shù)讀取長度(600～1 000 bp)，在3種測序技術(shù)中最長，可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序，但其通量最低(0.5～1 Gb/run)。當(dāng)遇到polymer(如AAAAAA等)時(shí)，堿基個(gè)數(shù)和熒光信號強(qiáng)度不成線性關(guān)系，即判斷重復(fù)堿基有困難。

Illumina/Solexa屬于高度自動(dòng)化的系統(tǒng)，讀取片段比其它種類的測序多，適合進(jìn)行大量小片段的測序(如microRNA profiling)，其測序通量大，其新機(jī)型Hiseq 2000產(chǎn)出量為600 Gb/run，但基于可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)輪數(shù)增加效率降低、信號減弱，并且讀長(通常為100 bp)比Roche/454短，給從頭測序拼接帶來困難。

ABI/SOLiD技術(shù)每個(gè)堿基讀取2次，有非常高的準(zhǔn)確性，特別是針對SNP的檢測。此外，靈活的系統(tǒng)和完善的磁珠編碼系統(tǒng)可以進(jìn)行樣品的pooling來分割測序區(qū)域，特別適用于具有高質(zhì)量參考基因組序列物種的重測序，但是該測序讀長(50 bp)最短，并且讀取長度受反應(yīng)輪數(shù)的限制，給從頭測序拼接帶來困難。

1.2 第三代測序技術(shù)(新一代測序技術(shù))

隨著第二代測序技術(shù)的不斷完善和廣泛應(yīng)用，單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)(SMRT)開始發(fā)展起來[14]，該技術(shù)徹底脫離了在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上捕捉信號的過程，達(dá)到了真正讀取單分子熒光的能力[15]。該技術(shù)在DNA聚合過程中就能知道產(chǎn)物測序。SMRT技術(shù)在成本、測序速度和讀取長度等方面都有著尤為突出的優(yōu)勢和潛力，對未來實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間投入少量資金對測定動(dòng)植物基因組的目標(biāo)前進(jìn)了一大步；但是該實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以支付。2010年底價(jià)格僅為普通測序儀的十分之一的PGMTM測序儀的出現(xiàn)解決了這個(gè)問題，它的設(shè)計(jì)原理是基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)，將待測DNA序列固定在半導(dǎo)體芯片的微孔中，再依次加入堿基，檢測不同堿基釋放出的氫離子而讀取出序列；其獨(dú)特的流體系統(tǒng)、半導(dǎo)體技術(shù)和微體系的機(jī)械設(shè)計(jì)的結(jié)合可在2 h內(nèi)獲取10 Mb～1 Gb以上的高精度的序列，在高通量測序的發(fā)展路程中又有了很大的進(jìn)步。

2 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用

隨著高通量測序技術(shù)不斷的發(fā)展，基因組研究進(jìn)入了新的階段，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于在微生物和動(dòng)植物基因組的研究。高通量測序技術(shù)除了用于大量的基因組序列分析外，還能用于基因表達(dá)水平的分析、RNA的鑒定、基因的篩選、DNA甲基化以及在醫(yī)學(xué)、臨床上的藥物篩選、治病原理等研究。

2.1 高通量測序技術(shù)在全基因組中的應(yīng)用

全基因組的測序的產(chǎn)生，使越來越多的物種基因組信息得到公布[16-17]，對更全面細(xì)致的了解一個(gè)物種的基因調(diào)控、物種進(jìn)化、基因組成等方面有了重大意義。2008年，美國科學(xué)家首次利用高通量技術(shù)獲得了人類全基因組[18]。2010年，中國研究人員參與大熊貓基因組測序，得到了世界第一個(gè)僅用高通量測序技術(shù)而來的基因組序列圖[19]。

2.2 高通量RNA測序中的應(yīng)用

最近，科學(xué)家利用高通量測序技術(shù)的結(jié)合，研發(fā)出RNA測序技術(shù)(RNA-Seq)，通過此技術(shù)可以檢測基因的表達(dá)情況以及對差異基因進(jìn)行篩選或分析。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、玉米、擬南芥、水稻、小麥和人類等生物的轉(zhuǎn)錄組測序[20-26]。

2.3 高通量測序技術(shù)在ChIP-Seq技術(shù)中的應(yīng)用

ChIP-Seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，chromatin immunoprecipitation)在組蛋白特異性修飾位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的研究中起著重要的作用，是研究蛋白與基因間的作用的工具[27]。最近研發(fā)的ChIP-Seq技術(shù)充分結(jié)合了高通量測序技術(shù)和ChIP的優(yōu)勢，更高效的研究目的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，該技術(shù)得到廣泛使用并取得了突出的成果[28-32]。

2.4 高通量測序技術(shù)在DNA甲基化分析中的應(yīng)用

DNA甲基化的功能主要體現(xiàn)在維持遺傳印記作用、細(xì)胞的功能以及胚胎的發(fā)育等方面。高通量測序技術(shù)使該功能更加精確，結(jié)合高通量測序技術(shù)研發(fā)出的DNA甲基化技術(shù)有：甲基化DNA免疫共沉淀測序技術(shù)、甲基結(jié)合蛋白測序技術(shù)和亞硫酸氫鹽測序技術(shù)[33-34]。現(xiàn)階段，DNA甲基化利用高通量技術(shù)的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻、擬南芥、蠶和人等[35-37]，并取得了顯著的成果。

3 高通量測序技術(shù)在畜禽的研究進(jìn)展

高通量技術(shù)為研究畜禽基因組、基因表達(dá)、基因調(diào)節(jié)機(jī)制、基因篩選、優(yōu)良品種改進(jìn)、獸藥篩選、畜禽體內(nèi)病毒致病機(jī)理和預(yù)防等方面取得了許多重要成果。以下簡介高通量測序技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例。

2011年5月，李新建等[38]通過高通量測序技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、siRNA技術(shù)，沉默TCTP，研究探索翻譯TCTP(控制腫瘤蛋白)對脂肪細(xì)胞分化中的作用和影響，對不同類型的瘦肉型豬和脂肪性豬的不同生長發(fā)育時(shí)期階段進(jìn)行脂肪組織和脂肪細(xì)胞中TCTP的表達(dá)規(guī)律研究；TCTP可能抑制脂肪的沉積，此發(fā)現(xiàn)為日后進(jìn)一步研究探索肥胖關(guān)鍵基因調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。廉傳江等[39]對豬的睪丸組織展開研究，以已知未成年及成年睪丸組織小RNAcDNA文庫為前提，使用Solexa高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析來鑒定豬miRNA，并繼續(xù)進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，同時(shí)預(yù)測并分析差異表達(dá)miRNA的靶基因及其相關(guān)功能，進(jìn)一步分析代表性差異表達(dá)miRNA在發(fā)育過程中不同組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明：借助高通量測序技術(shù)中Solexa測序，成功得到成熟與未成熟睪丸組織小分子RNA序列14 802 526條，原始小RNA序列14 660 953條，其中大于18 nt小分子序列為12 738 518條，其中大于18 nt的原始小RNA序列12 660 584條，與其對應(yīng)的unique序列分別為1 336 183條和2 053 109條；沒有發(fā)育成熟的豬睪丸組織中，最多的小RNA序列為22 nt的，占總序列的32.54%；21～23 nt的占60%以上；在成熟的豬睪丸組織中，小RNA的長度在26～30 nt的序列豐度約67%，遠(yuǎn)大于占11.5%的21～23 nt序列。成熟與未成熟的豬睪丸的總小RNA在組成上有顯著差異，且在成熟豬睪丸中的小RNA種類比未成熟的睪丸組織中豐富的多；通過利用生物信息學(xué)的分析，鑒定出了398個(gè)與豬已知同源保守的miRNA和138個(gè)新的豬候選miRNAs，其中有18個(gè)豬的新的特異性miRNAs；在成熟豬的睪丸miRNA序列的分析發(fā)現(xiàn)其miRNA的豐度及來源；以及和保守豬miRNAs的表達(dá)定量比較規(guī)律。并且通過10個(gè)miRNAs的熒光定量驗(yàn)證了Solexa測序分析的準(zhǔn)確性等重要結(jié)果和信息，以上研究結(jié)果為日后研究人員對豬的miRNA在精子的生成過程的作用及形狀表達(dá)等信息提供了理論依據(jù)。高其雙等[40]通過高通量測序技術(shù)的幫助下，分析ST細(xì)胞生長受不同濃度肝素的影響，發(fā)現(xiàn)肝素的濃度在5～20 U/mL時(shí)會對ST細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，為日后豬瘟疫苗的研發(fā)和改善提供了參考。

何川等[41]研究人員對雞胚的雌、雄性腺中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行了高通量測序分析，共獲得了雌、雄基因有表達(dá)顯著的有984個(gè)，miRNA43條。又通過該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有11個(gè)miRNA和3條信號通路可能參與雞的性腺分化和發(fā)育作用。這些結(jié)果將為日后進(jìn)一步對雞的性別決定與分化相關(guān)的分子機(jī)制提供參考和依據(jù)?？茖W(xué)家針對家禽中的鴨也取得了一些成果，如鴨的遺傳圖譜的構(gòu)建[42]；雞與鴨的基因比較及定位[43]；全基因組的構(gòu)建[44]；目的性克隆以及遺傳多態(tài)性分析等等[45]。?；蚪M的研究也在日益不斷創(chuàng)新和深入，在物理圖譜、遺傳圖譜、全基因組序列圖以及轉(zhuǎn)錄組研究都得到了尤為突出的成就，為牛業(yè)事業(yè)發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)，并得到了廣泛的應(yīng)用[46]。此外，高通量測序技術(shù)在鹿茸的生物學(xué)領(lǐng)域也有了一定的應(yīng)用，為鹿茸生長和發(fā)育機(jī)制有了一定的研究成果，同時(shí)也為提高鹿茸產(chǎn)量、藥產(chǎn)品質(zhì)量帶來了利益[47-49]。

4 高通量測序技術(shù)發(fā)展前景

雖然高通量測序技術(shù)優(yōu)勢眾多，但同時(shí)也有他的局限性，如雖然提供了快速的測序技術(shù)，但是后續(xù)大量數(shù)據(jù)分析卻為研究人員增加了工作量[50]。一般的高通量測序技術(shù)不適合小規(guī)模的測序，而且成本又高，不是一般小型的實(shí)驗(yàn)室能承擔(dān)得起的，因此，以前的傳統(tǒng)測序技術(shù)還不能被完全取代[51]。但是隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，有了更為先進(jìn)的改善，科學(xué)家研發(fā)出了既經(jīng)濟(jì)又實(shí)惠的高通量測序技術(shù)--單分子測序，并且有了很好的應(yīng)用和發(fā)展[2,52-56]，相信，隨著高通量技術(shù)的應(yīng)用和不斷的進(jìn)步，會有更加完善、更先進(jìn)的高通量測序技術(shù)發(fā)展起來，為日后的研究作出更大、更杰出的貢獻(xiàn)。

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