不同發(fā)酵天數(shù)對“栓錢菌質(zhì)”急性毒性及抗炎、鎮(zhèn)痛作用的影響

彭 薇， 孫 鈺， 潘 揚， 張 弦， 蔣亞平

（南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210029）

中藥馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nuxvomica L.的干燥成熟種子，2010版《中國藥典》記載其性溫，味苦，具通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫之效[1]，是中醫(yī)臨床常用的活血化瘀藥?，F(xiàn)代研究表明，馬錢子具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[2-3]，其主要有效成分是生物堿類，包括士的寧、馬錢子堿、士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物等。由于馬錢子“其毒甚烈”（《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》），故臨床內(nèi)服須用其炮制品?！半p向發(fā)酵”是作者所在實驗室創(chuàng)立的一種使藥用真菌與藥材組合進(jìn)行固體發(fā)酵以生產(chǎn)藥物的現(xiàn)代生物技術(shù)[4]，它為毒性中藥“降毒存效”開辟了一條新途徑[5]。前期作者運用該項技術(shù)對馬錢子進(jìn)行發(fā)酵減毒研究，已證實其經(jīng)朱紅栓菌Trametes cinnabarina發(fā)酵后形成的發(fā)酵品 （簡稱為“栓錢菌質(zhì)”）中多種原有的生物堿成分發(fā)生了質(zhì)和量的變化，毒性較大的士的寧和馬錢子堿含量呈現(xiàn)下降趨勢[6]；而毒性相對較小的士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加[7]。藥理實驗也表明:與馬錢子生品相比，“栓錢菌質(zhì)”毒性有所降低且保持了其原來的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[8]，這就說明馬錢子發(fā)酵減毒與目前公認(rèn)的炮制機理[9]基本相同。

一般認(rèn)為，為了獲得最佳發(fā)酵產(chǎn)品，當(dāng)“栓錢菌質(zhì)”的發(fā)酵終點達(dá)到時，必須終止發(fā)酵過程；如果發(fā)酵時間（天數(shù)）過長或過短，其降低毒性和提高（保持）藥效的效應(yīng)必將相應(yīng)變差。本實驗比較不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”急性毒性及抗炎、鎮(zhèn)痛作用的差別，旨在為其發(fā)酵終點的確定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與藥品

馬錢子藥材 （生品），購自南京市藥業(yè)股份公司，經(jīng)潘揚教授鑒定為馬錢科植物Strychnos nuxvomica L.的干燥成熟種子；吲哚美辛片，購自上海信誼九福藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與試劑

AE240電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；超凈工作臺，江蘇無錫空氣凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；微型高速萬能粉碎機，河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；巴豆油，杭州中香化學(xué)試劑有限公司提供；羧甲基纖維素鈉，國藥集團(tuán)試劑有限公司提供；水為純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物與菌種

ICR小鼠，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供；朱紅栓菌 Trametes Cinnabarina（Jacq.:Fr.） Fr.，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所分離、鑒定、保藏并復(fù)壯。

1.4 “栓錢菌質(zhì)”制備

按雙向固體發(fā)酵的制備工藝進(jìn)行操作[10-11]。將馬錢子粉碎成粗粒（過10目篩）5 g，加適量水稍潤濕，pH 自然，填裝入粗試管（φ 32 mm×200 mm），混合均勻，扎口，121℃高壓滅菌50 min，冷卻；從菌種斜面上切取綠豆粒大小的菌絲體（帶培養(yǎng)基）一塊，移入發(fā)酵基質(zhì)的表面（使二者需有接觸），扎口，置于培養(yǎng)箱中27℃恒溫培養(yǎng)。每天嚴(yán)密觀察紅栓菌在馬錢子（基質(zhì)）上的生長情況，分別在發(fā)酵至第0、7、20、41、48、62、69 天時， 掏取試管中的發(fā)酵物，60 ℃下干燥 4～6 h，即得“栓錢菌質(zhì)”（簡寫為“SQJZ”），低溫避光（4℃冰箱）保存。

1.5 試液配制

1.5.1 藥品混懸液的配制 馬錢子生品和不同時間段的發(fā)酵品，先粉碎成粗顆粒，然后加同等質(zhì)量的藥用淀粉混合均勻，再粉碎過80目篩，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%CMC-Na水溶液配成混懸液。使用前劇烈振搖1～2 min使均勻。

1.5.2 體積分?jǐn)?shù)0.5%醋酸溶液的配制 精密量取冰醋酸0.5 mL，加蒸餾水使溶散成100 mL，即得，密閉保存。

1.5.3 體積分?jǐn)?shù)2%巴豆油溶液的配制 精密量取巴豆油2 mL，加乙醚73 mL、無水乙醇20 mL使溶散，加蒸餾水至100 mL，即得，低溫密閉保存。

2 實驗方法

2.1 急性毒性實驗

將不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”的7個樣品分別進(jìn)行實驗。每個樣品取18～22 g小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組10只，以預(yù)試驗結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)慕M數(shù)（5～6組）和劑距。實驗前小鼠禁食（不禁水）12 h后，以0.2 mL/10 g的劑量灌胃給予不同濃度的藥物，觀察并記錄給藥后7 d內(nèi)小鼠的精神、活動、飲食、飲水、毛色、二便及死亡等情況，死亡動物及時進(jìn)行尸檢，采用 LD50 CALC（Ver.2.0）軟件（Bliss法）計算半數(shù)致死量（LD50）和95%可信限；并按下式計算不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”相對于馬錢子生品的毒性下降率（%）。

2.2 鎮(zhèn)痛作用

醋酸腹腔注射致小鼠扭體試驗[12]:取體質(zhì)量20～24 g雄性小鼠100只，按體質(zhì)量隨機分為10組，每組10只:①模型空白對照組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%CMCNa水溶液20 mL/kg）；②陽性對照組 （吲哚美辛20 mg/kg）；③生馬錢子藥材組（按生藥計20 mg/kg）；④—⑩分別為發(fā)酵 0、7、20、41、48、62、69 d 的“栓錢菌質(zhì)”（按發(fā)酵品計20 mg/kg），各組給藥體積按20 mL/kg一次性灌胃。給藥后0.5 h，各組小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.5%醋酸溶液0.2 mL/只，觀察并記錄注射醋酸15 min內(nèi)各小鼠發(fā)生扭體反應(yīng)（腹部內(nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起）的次數(shù)。

2.3 抗炎作用

對巴豆油所致鼠耳腫脹的影響[12]:取體質(zhì)量20～24 g雄性小鼠100只，按體質(zhì)量隨機分為10組，每組10只:①模型空白對照組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%CMC-Na水溶液20 mL/kg）；②陽性對照組（吲哚美辛20 mg/kg）；③生馬錢子藥材組（按生藥計20 mg/kg）；④—⑩分別為發(fā)酵 0、7、20、41、48、62、69 d 的“栓錢菌質(zhì)”（按發(fā)酵品計20 mg/kg），各組每日灌胃1次，給藥體積按20 mL/kg，連續(xù)給藥4 d。末次給藥0.5 h后，用體積分?jǐn)?shù)2%巴豆油溶液0.05 mL涂于小鼠右耳兩側(cè)，左耳不涂作為正常對照。致炎后4 h，將小鼠頸椎脫臼致死，自耳廓剪下左、右兩耳，用打孔器（直徑9 mm）分別在兩耳的同一部位打一圓耳片，電子天平稱質(zhì)量（精確至0.1 mg），記錄每鼠左右耳片的質(zhì)量（mg），計算其耳廓腫脹度（即每鼠右耳片質(zhì)量減去左耳片質(zhì)量）（mg），并按下式得出耳廓腫脹下降率（%）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

以上鎮(zhèn)痛、抗炎結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，耳廓腫脹度（mg）和扭體次數(shù)計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），方差齊者采用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2法，P＜0.05者為差異有顯著意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 對急性毒性的影響 各組小鼠灌服不同發(fā)酵天數(shù)藥液后，均出現(xiàn)不同程度的興奮癥狀，如活動明顯增多、煩躁不安，甚至驚厥、抽搐而死亡，死亡時間一般在30 min內(nèi)。低劑量小鼠中毒潛伏期較長，多在3～5 h后死亡，有的給藥后小鼠反復(fù)抽搐而不死亡，后逐漸恢復(fù)正常，其活動、飲食及精神狀態(tài)也與未給藥小鼠基本相同。對中毒死亡小鼠進(jìn)行解剖后未發(fā)現(xiàn)病變組織。不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”毒性下降率（%）大小如下:0 d≈7 d＜20 d≈41 d＜48 d＜62 d＜69 d。 不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”的 LD50值和毒性下降率見表1。

表1 不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”的急性毒性Table 1 Effect of fermentation days in the acute toxicity of SQJZ

3.1.2 對鎮(zhèn)痛作用的影響 扭體反應(yīng)次數(shù)大小如下: 空白≥69 d≈62 d＞48 d＞41 d≈20 d＞0 d＞7 d＞生品＞吲哚美辛，且與空白對照相比，生品，發(fā)酵0、7、20、41、48 d者均明顯減少醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)（P＜0.05），表明發(fā)酵48 d內(nèi)鎮(zhèn)痛作用沒有明顯下降；而62 d和69 d者則鎮(zhèn)痛作用消失，與陽性對照（吲哚美辛）相比有極顯著性差異（P＜0.01）。扭體反應(yīng)次數(shù)數(shù)據(jù)見表2。

3.1.3 對抗炎作用的影響 耳廓腫脹率（%）大小如下:空白≥69 d＞62 d＞20 d＞7 d≈0 d＞48 d＞41 d＞生品＞吲哚美辛，且與空白對照相比，生品，發(fā)酵0、7、20、41、48 d者均可顯著抑制致炎后小鼠的耳廓腫脹率（P＜0.05或0.01），表明發(fā)酵48 d內(nèi)抗炎作用沒有明顯變化。耳廓腫脹度（mg）及耳廓腫脹率（%）數(shù)據(jù)見表2。

3.2 結(jié)果與討論

實驗結(jié)果表明，不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”毒性下降率（%）大小如下:發(fā)酵 0 d≈7 d＜20 d≈41 d＜48 d＜62 d＜69 d。扭體反應(yīng)次數(shù)大小如下:發(fā)酵69 d≈62 d＞48 d＞41 d≈20 d＞0 d＞7 d； 與空白對照相比， 發(fā)酵 0、7、20、41、48 d 者與馬錢子生品一樣，均明顯減少醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)（P＜0.05），表明發(fā)酵48 d內(nèi)基本保留了生品原有的鎮(zhèn)痛作用；而62 d和69 d者則此活性消失，且與陽性對照（吲哚美辛）相比有極顯著性差異（P＜0.01）。耳廓腫脹下降率（%）大小如下:發(fā)酵 7 d≈20 d＞41 d＞48 d＞0 d＞＞62 d＞69 d，與空白對照相比，發(fā)酵 0、7、20、41、48 d者與生品相同，皆可顯著抑制致炎后小鼠的耳廓腫脹率（P＜0.05或0.01），表明發(fā)酵48 d內(nèi)抗炎作用沒有明顯變化。

表2 不同發(fā)酵天數(shù)“栓錢菌質(zhì)”的鎮(zhèn)痛和抗炎作用Table 2 Effect of fermentation days on the analgesic and anti-inflammatory effects of SQJZ

表面上看，發(fā)酵62 d和69 d者急性毒性下降率雖然分別達(dá)162.7%和205.4%，毒性相比馬錢子生品下降幅度較大，但實質(zhì)上二者的鎮(zhèn)痛和抗炎作用已喪失，故仍以48 d或41 d者（毒性下降率各為77%和28.6%）為佳。另外，比較分析發(fā)酵41 d和48 d“栓錢菌質(zhì)”的鎮(zhèn)痛和抗炎作用，除了這二者的兩種作用與馬錢子生品保持基本一致外，41 d者鎮(zhèn)痛作用稍強；而48 d者抗炎作用略勝。

4 結(jié)語

綜上所述，“栓錢菌質(zhì)”制備所需發(fā)酵天數(shù)要控制在一個合理的范圍內(nèi)，發(fā)酵時間過短不能達(dá)到降低毒性的目的，而發(fā)酵時間過長則會影響馬錢子原有的臨床作用效果，因此最后確定其發(fā)酵終點應(yīng)選擇在第41～48 d較適宜。至于其中有毒成分和有效成分質(zhì)和量的變化，還有待于進(jìn)一步深入研究。

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