一種耐低溫α-乙酰乳酸脫羧酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)

李靜靜， 徐美娟， 張 顯， 饒志明

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

雙乙酰（Diacetyl，DA）是一種重要的風(fēng)味物質(zhì)，可以使黃油、奶油、脫脂乳和許多新鮮發(fā)酵的乳制品具有特殊風(fēng)味和香氣[1]。DA含量也是判斷啤酒成熟與否的重要指標(biāo)，啤酒中DA的口味閾值較低，只有0.02～0.10 mg/L，當(dāng)其含量超過閾值時(shí)就會(huì)給啤酒帶來不愉快的味道[2]。α-乙酰乳酸脫羧酶 （αacetolactate decarboxylase，α-ALDC，EC.4.1.1.5）能催化DA的前體物α-乙酰乳酸快速脫羧形成乙偶姻，避免了DA的生成[3]，它可以縮短啤酒熟化周期，提高生產(chǎn)效率，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

ALDC于1952年首次從產(chǎn)氣腸桿菌中分離得到，之后很多學(xué)者就該酶在生物界中的分布及基因克隆等展開了研究。Godtfredsen等[4]的研究表明，很多細(xì)菌具有ALDC活性，但目前在真菌、海藻和原生動(dòng)物等真核生物中還未發(fā)現(xiàn)該酶的存在。釀酒酵母不含有ALDC基因，而細(xì)菌中天然存在的ALDC產(chǎn)量也很低，因此，要想將該酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)，研究ALDC的分子結(jié)構(gòu)以及ALDC基因，進(jìn)行基因的克隆和表達(dá)，提高酶的產(chǎn)量，是必然的選擇。隨著對(duì)ALDC分子水平研究的深入，ALDC基因已經(jīng)從多種菌株中克隆得到[5-8]，并在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母中獲得了不同程度的表達(dá)。高健等[9]從枯草芽孢桿菌BD-5克隆得到了ALDC基因，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，但是酶活不高。李聯(lián)政等[8]從枯草芽孢桿菌168中擴(kuò)增到ALDC基因，在大腸桿菌中表達(dá)酶活為0.11 U/mL。廖東慶等[10]將ALDC表達(dá)原件整合到枯草芽孢桿菌基因組中，得到的ALDC酶活為15.6 U/mL。有關(guān)酵母中整合表達(dá)的研究顯示，ALDC表達(dá)的酶活較低。不同來源的ALDC的最適溫度及穩(wěn)定性等性質(zhì)存在差異，已報(bào)道的ALDC最適作用溫度集中在30～40℃，丹麥諾維信公司開發(fā)的ALDC酶制劑Maturex的最適作用溫度也達(dá)到了35～40℃。而啤酒生產(chǎn)中正常的發(fā)酵溫度只有10℃左右，在該溫度下，ALDC酶活力只能達(dá)到其最高活力的15%～20%，這大大削弱了酶的作用效率，造成極大的浪費(fèi)，同時(shí)也提高了生產(chǎn)成本。因此獲得一種耐低溫ALDC就具有了十分重要的意義。

作者所在實(shí)驗(yàn)室前期通過低溫篩選得到一株ALDC活性較高的菌株Bacillus subtilis L5-20，獲得的純酶在啤酒發(fā)酵中進(jìn)行了初步試驗(yàn)，能有效降低DA的含量，但原始菌ALDC的表達(dá)量偏低。本研究中以Bacillus subtilis L5-20為出發(fā)菌，克隆其ALDC基因，構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌。對(duì)重組ALDC進(jìn)行Ni-NTA柱純化，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，以及在5 L的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)研究，以期獲得高表達(dá)且更適用于啤酒發(fā)酵的ALDC，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

B.subtilis L5-20由作者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得，大腸桿菌Escherichia coli JM109和B.subtilis WB600由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，克隆載體pMD18-T購(gòu)自Takara公司，表達(dá)載體pMA5由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

工具酶、IPTG，購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、咪唑、抗生素、α-萘酚、肌酸、2-（N-馬啉代）乙磺酸和 Brij35，購(gòu)自上海Sangon公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（American Promega Corporation）、廣范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自Fermentas公司；2-乙酰基-2-甲基乙酰乙酸乙酯（ethyl-2-acetoxy-2-methylacetocetate），購(gòu)自 Sigma Aldrich公司；PCR引物，由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑純。

LB培養(yǎng)基:酵母粉0.5 g/dL，蛋白胨1 g/dL，NaCl 1 g/dL，pH 7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:大豆蛋白胨1 g/dL，葡萄糖4 g/dL， 玉米漿 1.5 g/dL， 尿素 0.3 g/dL，K2HPO4·3H2O 0.17 g/dL，KH2PO40.23 g/dL，MgSO4·7H2O 0.075 g/dL，NaCl 5 g/dL，pH 6.8～7.0。

1.3 主要試劑配制

酶活測(cè)定緩沖液 MES I（pH 6.0）:0.05 mol/L 2-（N-馬啉代） 乙磺酸、0.05 g/dL Brij35、0.6 mol/L NaCl，用 1 mol/L NaOH 調(diào) pH。

底物緩沖液 MESⅡ （pH 6.0）:0.05 mol/L 2-（N-馬啉代）乙磺酸，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.0。

顯色劑:將質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%α-萘酚（用正丙醇溶解）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%肌酸、蒸餾水按比例（1∶1∶1∶6.8）混合。 注意，顯色劑要在用前配置，另外α-萘酚要避光保存。

底物:取100 μL 2-乙?；?2-甲基乙酰乙酸乙酯，加入6 mL 0.5 mol/L NaOH，不?；蝿?dòng)20 min后，用0.5 mol/L HCl調(diào)pH 6.0，用MESⅡ緩沖液定容至50 mL。注意，該底物溶液需在使用前配制。

1.4 ALDC基因alsD的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI枯草芽孢桿菌的全基因組核酸序列中ALDC的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Forward/Reverse（見表1），在下游序列插入6個(gè)His編碼基因（斜體部分），并在引物的5’端分別加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。

提取B.subtilis L5-20染色體DNA為模板，以Forward/Reverse引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段 alsD-His，PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性1 min，然后 94℃變性 1 min；56℃退火 1 min，72℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。所得基因片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為T-alsD-His，DNA測(cè)序由上海Sangon公司完成。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒T-alsD-His，用BamH I和Mlu I雙酶切后連接到經(jīng)相同酶切的pMA5上，構(gòu)建表達(dá)載體pMA5-alsD-His。

表1 文中所涉及的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 ALDC在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)載體pMA5-alsD-His轉(zhuǎn)化至B.subtilis WB600中，轉(zhuǎn)化過程參照Spizizen所述的方法進(jìn)行。在卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組子，并經(jīng)酶切驗(yàn)證。將經(jīng)驗(yàn)證正確的重組菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600接種至含有 50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，次日以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h。將發(fā)酵液于10 000 r/min 4℃離心15 min，發(fā)酵液上清液用于重組菌胞外ALDC酶活的測(cè)定，收集菌體，用0質(zhì)量分?jǐn)?shù).85%NaCl洗滌2次，然后懸浮于MES I（pH 6.0）緩沖液中。采用超聲波細(xì)胞破碎法破碎細(xì)胞（300 W，工作2 s停5 s，工作時(shí)間 10 min），15 000 r/min 4 ℃離心 30 min，所得上清液用于重組菌胞內(nèi)ALDC酶活的測(cè)定。

1.6 酶的Ni-NTA純化

發(fā)酵后離心收集菌體，用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌3次，重懸于McAc-0溶液 （20 mM Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10% 甘油），采用超聲破碎制得粗酶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni-NTA蛋白純化柱純化目的蛋白質(zhì)，經(jīng)過兩次上樣，依靠蛋白末端6個(gè)His與Ni-NTA的金屬離子進(jìn)行螯合。洗脫過程首先用不含有咪唑的緩沖液洗柱，目的是洗脫未與Ni-NTA結(jié)合的細(xì)胞體雜蛋白，然后用不同濃度的咪唑（20～300 mmol/L）緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)蛋白質(zhì)的大小與金屬離子的結(jié)合牢固程度，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測(cè)定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.7 ALDC酶活力的測(cè)定

參照Garmyn[7]，陳卿[11]等所述的方法并加以調(diào)整。

ALDC催化α-乙酰乳酸脫羧生成乙偶姻，乙偶姻在堿性條件下可以與肌酸和α-萘酚的混合物反應(yīng)生成紅色的物質(zhì)，在一定的范圍內(nèi)生成的紅色物質(zhì)的吸光值與乙偶姻的含量成正比，根據(jù)這一原理，來測(cè)定ALDC的活性。一個(gè)單位酶活（U）定義為:在30℃，pH 6.0的反應(yīng)條件下，1 min使a-乙酰乳酸脫羧形成1 μmol乙偶姻所需的酶量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取溶于MES I的乙偶姻各400 μL（乙偶姻的含量分別為 5、10、15、20、25 μg），加入顯色劑4.6 mL，30℃水浴30 min顯色后于520 nm處測(cè)吸光值，以400 μL MES I加4.6 mL顯色劑作為空白對(duì)照。繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于下一步酶活的計(jì)算。

酶活的測(cè)定:200 μL酶液與200 μL底物混合，在30℃水浴反應(yīng)10 min加入4.6 mL顯色劑30℃水浴30 min顯色，520 nm處測(cè)定吸光值。

1.8 酶學(xué)性質(zhì)的研究方法

1.8.1 最適pH及pH穩(wěn)定性 用底物緩沖液MESⅡ配制不同 pH（3.0～11.0）的底物溶液，將酶液用MES I稀釋一定倍數(shù)，然后將不同pH的底物380 μL與稀釋好的酶液20 μL反應(yīng)，測(cè)定不同pH條件下ALDC的活性，考察pH值對(duì)其酶促反應(yīng)的影響。配制不同pH（5.0～10.0）的酶活測(cè)定緩沖液MES I，用它們來稀釋酶液得到不同pH的酶液。讓酶處于不同pH環(huán)境中，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定酶的剩余活性；反應(yīng)體系為:20 μL 酶液，180 μL MES I，200 μL底物。以蒸餾水代替酶液作為空白對(duì)照，考察該酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性。

1.8.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 在10～45℃設(shè)置8個(gè)反應(yīng)溫度 10、15、20、25、30、35、40、45 ℃，測(cè)定不同溫度條件下ALDC的酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。 將適當(dāng)稀釋的酶液分別在–20、0、25、35、45、55、65、75℃保溫，每隔2 h取樣，測(cè)定不同溫度下酶的剩余活力，從而研究該酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.8.3 不同金屬離子以及EDTA對(duì)酶活的影響分別在反應(yīng)體系中加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Sn2+、Ni2+、Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+離子以及EDTA，以不加金屬離子的反應(yīng)體系為對(duì)照，研究各金屬離子對(duì)ALDC酶活的影響。

1.8.4 Km值及Vmax的測(cè)定 配置不同濃度的α-乙酰乳酸底物溶液，分別進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間控制在2 min。采用 Lineweaver-Burk作圖法確定ALDC的Km及Vmax值。

1.9 重組枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 重組枯

草芽孢桿菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)36 h，進(jìn)行ALDC酶活測(cè)定。并在5 L的發(fā)酵罐上進(jìn)行放大試驗(yàn)，裝液量為2.5 L，接種量4%，轉(zhuǎn)速 350 r/min，通氣量 1 L/（L·min），37 ℃培養(yǎng) 48 h，發(fā)酵過程中跟蹤檢測(cè)菌體濃度、殘?zhí)呛考癆LDC酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALDC基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

提取B.subtilis L5-20全基因組DNA，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為786 bp（其中包含18 bp的His編碼序列）的基因片段（圖1）。

將T-alsD-His用BamH I和Mlu I進(jìn)行雙酶切，將其與經(jīng)相同酶切線性化的表達(dá)載體pMA5連接，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中。獲得的重組表達(dá)載體pMA5-alsD-His經(jīng)BamH I和Mlu I雙酶切驗(yàn)證（圖2），得到約7 000 bp和780 bp大小的片段，分別對(duì)應(yīng)線性pMA5和alsD-His的大小，表明外源基因alsD-His已經(jīng)正確連接到表達(dá)載體pMA5上。

圖1 alsD基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of alsD gene

圖2 重組質(zhì)粒pMA5-alsD-His的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pMA5-alsD-His by enzyme digestion

2.2 alsD基因在B.subtilis WB600中的表達(dá)及重組蛋白ALDC的純化

將重組載體pMA5-alsD-His轉(zhuǎn)化至B.subtilis WB600中，在卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組子，即得重組菌株pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600，將其接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，收集菌體并洗滌，菌體用MES I緩沖液懸浮，采用超聲波破碎細(xì)胞，破碎上清液SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為 32×103，與預(yù)期分子量大小相符，表明ALDC在B.subtilis WB600成功獲得了表達(dá)。同時(shí)測(cè)定粗酶液中的蛋白含量以及酶活力，得知其中蛋白含量為91.0 mg，總酶活為3 395.0 U，比酶活為37.3 U/mg。經(jīng)Ni-NTA純化后得到較純的酶液，測(cè)得其中蛋白含量為11.2 mg，總酶活為3 050.0 U，比酶活為272.3 U/mg，純化后的比酶活是純化前的7.3倍，酶活回收率為89.8%。SDS-PAGE結(jié)果（圖3）看出經(jīng)過純化得到較純的重組ALDC蛋白，純化效果見表2。

圖3 重組枯草芽孢桿菌ALDC表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ALDC

表2 重組蛋白ALDC純化情況Table 2 Purification of recombinant ALDC

2.3 重組ALDC的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適pH值及pH穩(wěn)定性 配置pH 3.0～11.0的反應(yīng)緩沖液，分別測(cè)定不同pH下ALDC的酶活力，結(jié)果見圖 4。 由圖 4（a）可知，ALDC 在 pH 5.0～7.0范圍內(nèi)均具有較高的活力，最適pH為6.0。當(dāng)pH大于7.0時(shí)酶活力迅速下降，pH 8.0和pH 9.0條件下的酶活力約為最大酶活的34%，在pH 3.0～4.0及pH 11.0條件下酶活幾乎為零。

圖4 α-乙酰乳酸脫羧酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of ALDC

將ALDC分別在pH 5.0～10.0條件下處理，測(cè)定酶活性。從圖4（b）中可以看出，ALDC在pH 6.0～9.0環(huán)境中較穩(wěn)定，在pH 6.0和pH 7.0條件下處理10 h后，剩余酶活仍在90%以上；在pH 8.0和pH 9.0條件下處理10 h后，剩余酶活也在70%以上。在pH 5.0與pH 10.0環(huán)境下，該酶的活性在2.5 h內(nèi)迅速下降，并且在10 h后活性完全消失。表明該重組ALDC較適應(yīng)中性范圍的環(huán)境，對(duì)酸性及強(qiáng)堿性環(huán)境敏感。

2.3.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性 在10～45℃范圍內(nèi)，進(jìn)行ALDC的酶促反應(yīng)，結(jié)果如圖5（a）所示，隨著溫度的升高，ALDC酶活呈上升的趨勢(shì)，在25℃時(shí)達(dá)到最大值，此后開始呈下降趨勢(shì)，在20～35℃范圍內(nèi)，ALDC顯示較高的活力，最適反應(yīng)溫度為25℃。

將重組 ALDC 分別在-20、0、25、35、45、55、65、75℃條件下保存一定的時(shí)間后，測(cè)定酶活力大小。結(jié)果如圖5（b）顯示，在25℃以下，該酶非常穩(wěn)定，保溫10 h后剩余酶活仍有95%左右。在35℃和45℃環(huán)境下保存10 h后剩余酶活分別在60%和70%以上。55℃時(shí)保溫10 h后剩余酶活力不足20%。而當(dāng)溫度升高到65℃時(shí)，保存4 h即接近完全失活。

圖5 α-乙酰乳酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性Fig.5 Optimal temperature and thermal stability of ALDC

2.3.3 金屬離子以及EDTA對(duì)酶的影響 通過單獨(dú)添加相同終濃度（1 mmol/L）的不同金屬離子以及EDTA，研究它們對(duì)ALDC酶活力的影響，結(jié)果如表3所示。 Ni2+對(duì) ALDC 有一定的激活作用，Ca2+、Cu2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+、Na+、K+、Li+、EDTA 對(duì)其活性有不同程度的抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最小，Cu2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+次之，Na+、K+、Li+、EDTA 的抑制作用較為強(qiáng)烈，而Fe3+使ALDC活性完全喪失，Mg2+對(duì)ALDC既沒有激活也沒有抑制作用。

表3 金屬離子及EDTA對(duì)ALDC的影響Table 3 Effect of ions and EDTA on ALDC

2.3.4 Km值及Vmax的測(cè)定 根據(jù)不同底物濃度與酶促反應(yīng)的關(guān)系，按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法，計(jì)算得出重組ALDC的Km及Vmax值。如圖 6 所示，ALDC 的Km值為 29.04 μmol/L，Vmax為2.82 mmol/（L·min）。

圖6 ALDC的Lineweaver-Burk作圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot of recombinant ALDC

2.4 重組枯草芽孢桿菌ALDC的表達(dá)

將pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600接種至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)測(cè)定，胞外ALDC酶活為4.9 U/mL，胞內(nèi)ALDC酶活為22.1 U/mL，總酶活為 27.0 U/mL，約為出發(fā)菌B.subtilis L5-20 ALDC總酶活的70倍。

2.5 重組枯草芽孢桿菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600的發(fā)酵產(chǎn)酶研究

重組枯草芽孢桿菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)36 h，ALDC酶活測(cè)定結(jié)果顯示，胞外ALDC酶活為22.6 U/mL，胞內(nèi)酶活為43.2 U/mL，總酶活為65.8 U/mL。

將重組菌在5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行放大試驗(yàn)，結(jié)果見圖7。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌體量在前期呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，36 h時(shí)達(dá)到最大值，此后進(jìn)入平衡期并開始緩慢下降；ALDC酶活的變化與菌體量呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，在36 h達(dá)到最大，約75.9 U/mL，其中胞內(nèi)、胞外ALDC酶活分別為46.6 U/mL和29.3 U/mL。

圖7 重組枯草芽孢桿菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600 5 L罐發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation results of pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600 in 5 L bioreactor

3 結(jié)語

從一株耐低溫B.subtilis L5-20中克隆得到alsD基因，將其連接到表達(dá)載體pMA5上，并轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600，構(gòu)建重組菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600。選用Ni柱親和層析純化重組ALDC，純化后比酶活達(dá)272.3 U/mg，回收率為89.8%，純化倍數(shù)為7.3，并用所得的純酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。這是B.subtilis ALDC首次在枯草芽孢桿菌中的游離表達(dá)和純化。

已報(bào)道的ALDC最適作用溫度都在40℃左右。Rasmussen等[12]從干酪乳桿菌中純化出的ALDC的最適溫度為40℃。Ohshiro等[13]研究了乙酰短桿菌的ALDC，最適反應(yīng)溫度也為40℃，60℃以上迅速失活。尹東等[14]的研究顯示，產(chǎn)氣腸桿菌ALDC的適合溫度為35～45℃。鄭華軍等[15]研究的地衣芽孢桿菌ALDC最適溫度為40℃，且對(duì)熱（40℃以上）敏感。作者研究獲得的重組ALDC最適溫度為25℃，在20～35℃范圍內(nèi)均表現(xiàn)出較高的活性，該酶顯示出一定的耐低溫特性，在15℃酶活力還保留在最高活力的70%左右，10℃時(shí)酶活力仍保留在最高活力40%以上，這一優(yōu)異的特性使它更加適合啤酒生產(chǎn)的條件，極大地提高了酶的催化效率，降低了生產(chǎn)成本。

本研究小組前期將B.subtilis L5-20的alsD基因在大腸桿菌中表達(dá)，ALDC酶活為10.3 U/mL，雖然酶活比之前的報(bào)道有較大提高，但利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)來源于枯草芽孢桿菌的ALDC效果并不理想。且考慮到大腸桿菌屬于潛在致病菌，不適用于食品添加劑用酶的工業(yè)化應(yīng)用；并且目前利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)多為胞內(nèi)表達(dá)，后期提取工藝較復(fù)雜，因此從安全性和操作成本上分析，選擇一種高效胞外表達(dá)枯草芽孢桿菌基因的宿主是非常必要的。ALDC作為食品工業(yè)酶制劑，對(duì)其安全無毒害的要求較為嚴(yán)格，而枯草芽孢桿菌有長(zhǎng)期制備發(fā)酵食品的歷史，不產(chǎn)內(nèi)毒素和致熱敏蛋白質(zhì)，是一種公認(rèn)安全的微生物，無論是作為出發(fā)菌還是宿主菌都具有很強(qiáng)的可行性。雖然原始菌B.subtilis L5-20具有ALDC活性，但是其表達(dá)量對(duì)于工業(yè)酶制劑生產(chǎn)來說還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。鑒于以上因素，作者采用基因工程手段，選擇枯草芽孢桿菌作為表達(dá)的宿主菌，將alsD基因在B.subtilis WB600中獲得高效表達(dá)，重組菌經(jīng)LB培養(yǎng)后ALDC酶活達(dá)27.0 U/mL，約為出發(fā)菌酶活的70倍。而經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，ALDC酶活高達(dá)65.8 U/mL，再經(jīng)5 L的發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，ALDC酶活達(dá)75.9 U/mL（其中胞內(nèi)胞外ALDC酶活分別為46.6 U/mL和29.3 U/mL），較出發(fā)菌得到了極大地提升，較先前在大腸桿菌中表達(dá)的酶活也提高了很多，與已報(bào)道的重組菌酶活相比有很大的優(yōu)勢(shì)，該重組菌具有很好的開發(fā)潛力。

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