草蓯蓉水萃取物對脂多糖與D-氨基半乳糖所致小鼠肝臟氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

尹學(xué)哲， 許惠仙， 趙文璽， 全吉淑

（1.延邊大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

草蓯蓉 （Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov）又名不老草，為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，國家二類保護植物。草蓯蓉性味甘、酸、澀，全草入藥。具有補腎壯陽、潤腸止血、滋補強身、延年益壽的功效；用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、老年性習(xí)慣便秘、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎、前列腺炎，以及腎臟和膀胱出血等疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，草蓯蓉具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、增強免疫及抗腫瘤等作用[1-3]，這與草蓯蓉醛、草蓯蓉內(nèi)酯、草蓯蓉酸、草蓯蓉堿、草蓯蓉納拉苷和糖類等多種活性成分有關(guān)[4]。草蓯蓉多糖是從草蓯蓉中提取出來的生物活性成分，是草蓯蓉水萃取物（BRAF）的主要成分[5]。它無毒，具有抗腫瘤和免疫增強功能[4-5]。本實驗通過建立脂多糖（LPS）及D-氨基半乳糖（GalN）聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，觀察BRAF對小鼠急性肝損傷的保護作用，為草蓯蓉的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量為18～22 g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和儀器 LPS及GalN，Sigma公司產(chǎn)品；水飛薊素（SIL），沈陽東陵藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；TNF-α ELISA試劑盒，武漢博士德公司產(chǎn)品；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及蛋白質(zhì)試劑盒，南京建成科技有限公司產(chǎn)品。3-30K型離心機，Sigma公司提供；S22PC型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RT-2100型酶標(biāo)儀，深圳雷杜公司產(chǎn)品；BA200型生物顯微鏡，中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BRAF的制備 草蓯蓉采自吉林省長白山，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院劉勇鎮(zhèn)教授鑒定為草蓯蓉Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov。草蓯蓉用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇提取后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，水層經(jīng)減壓蒸餾，即得BRAF，得率約為3.2%[2]。主要成分有多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)67.0%）和蛋白質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.1%）。

1.2.2 實驗動物分組及處理 將小鼠按體質(zhì)量隨機分為5組，即正常組、模型組，BRAF高、低劑量組和SIL組。每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，BRAF高、低劑量分別為240、120 mg/kg，SIL劑量50 mg/kg，正常組及模型組小鼠則以等體積蒸餾水灌胃。末次給藥1 h后，除正常組外，其余各組小鼠腹腔注射給予500 mg/kg GalN和10 μg/kg LPS（用無菌生理鹽水配制）。造模期間禁食，不禁水。

1.2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶及TNF-α水平的檢測 造模1.5 h后，分離血清，ELISA法檢測小鼠血清TNF-α含量。再次造模8 h后，分離血清，檢測小鼠血清ALT、AST活性。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查 造模8 h后處死動物，取小鼠肝左葉，固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.5 肝組織氧化應(yīng)激與抗氧化相關(guān)指標(biāo)、DNA損傷及細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測 4℃裂解肝細(xì)胞，離心取上清液。按測試盒操作方法測定CAT、GPx、GST、GSH、MDA、NO 水平。 提取肝細(xì)胞 DNA，上瓊脂糖凝膠電泳，檢測肝細(xì)胞DNA損傷情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間均數(shù)比較采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，以單因素方差分析和Turkey's多因素t檢驗進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRAF 對急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響

如圖1所示，模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，可見大量肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞核明顯大小不等，呈不同程度的固縮，凋亡嚴(yán)重，可見大量凋亡小體。BRAF和SIL干預(yù)均能減輕上述肝組織病理學(xué)損傷，凋亡肝細(xì)胞明顯減少。

圖1 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果 （HE×200）Fig.1 Pathological observation of liver sections（HE×200）

2.2 BRAF對急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST、TNF-α以及肝組織NO水平的影響

如表1所示，腹腔注射GalN/LPS后1.5 h，模型組小鼠血清TNF-α水平升高，注射8 h時模型組小鼠血清ALT和AST活性明顯上升，肝組織NO水平也明顯升高（P＜0.05）；而BRAF高、低劑量組和SIL組小鼠血清ALT、AST、TNF-α和肝NO水平與模型組比較明顯降低（P＜0.05）。

表1 BRAF對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、TNF-α和肝組織NO水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 1 Effect of BRAF on serum TNF-α and hepatic NO levels of mice with acute liver injury（xˉ±s，n=10）

2.3 BRAF對急性肝損傷小鼠肝組織抗氧化活力和脂質(zhì)過氧化水平的影響

如表2所示，腹腔注射LPS和GalN明顯降低模型組小鼠肝組織 CAT、GPx和 GST活性 （P＜0.05），降低肝臟 GSH 水平（P＜0.05），增高肝臟 MDA含量 （P<0.05）。而BRAF治療可回升小鼠肝CAT、GPx、GST 活性和 GSH 含量（P<0.05），降低肝 MDA水平。說明BRAF可升高GalN/LPS所致急性肝損傷小鼠肝臟抗氧化防御能力，降低肝臟氧化應(yīng)激。

2.4 BRAF對急性肝損傷小鼠肝組織DNA損傷的影響

DNA電泳結(jié)果顯示，注射LPS和GalN可明顯增高模型組小鼠肝細(xì)胞DNA損傷，損傷肝細(xì)胞DNA斷裂形成梯形條帶，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的結(jié)構(gòu)特征。另有部分DNA隨機降解成模糊涂片狀，呈現(xiàn)細(xì)胞壞死特征。電泳圖條帶的灰度值比較結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞DNA斷裂和降解均明顯高于正常組（P＜0.05），而BRAF和SIL預(yù)處理可明顯降低急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞DNA斷裂和降解程度（P＜0.05）。

表 2 BRAF 對急性肝損傷小鼠肝組織 CAT、GPx、GST、GSH 和 MDA 水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 2 Effect of BRAF on hepatic CAT，GPx，GST，GSH and MDA levels of mice with acute liver injury（xˉ±s，n=10）

圖2 BRAF對急性肝損傷小鼠肝組織DNA損傷的影響Fig.2 Effect of BRAF on DNA damage of liver in mice with acute liver injury

3 討論

肝損傷是指在一系列理化因素的作用下，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡的病理狀態(tài)。在肝細(xì)胞病變過程中，自由基、酶及脂質(zhì)過氧化等均發(fā)揮主要作用[6]。GalN/LPS誘導(dǎo)的肝損傷小鼠是研究急性肝損傷十分理想的動物模型。GalN誘發(fā)的動物肝組織損傷在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上與人類急性重癥肝炎相似，而小劑量LPS可誘導(dǎo)GalN致敏小鼠發(fā)生以細(xì)胞凋亡為重要特征的急性肝功能衰竭[7]。細(xì)胞凋亡過程中氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵性作用，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機體活性氧自由基產(chǎn)生過多，同時抗氧化體系功能下降，進而對機體產(chǎn)生損傷[8]。為了對抗氧化應(yīng)激引起的各種損傷，有氧生物在進化過程中發(fā)展了多種抗氧化防御機制，包括各種抗氧化酶和解毒酶，如 SOD、CAT、GPx和 GST等，可與GSH等抗氧化劑一起有效清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，使機體免受自由基的損害[9]。本實驗表明，模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織抗氧化酶活性及GSH水平降低，肝臟脂質(zhì)過氧化水平升高。BRAF預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)這些血清及肝臟指標(biāo)，提示BRAF可提高GalN/LPS所致急性肝損傷小鼠肝臟抗氧化防御能力和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制急性肝衰竭氧化應(yīng)激，這可能是BRAF保護肝損傷的重要機制之一。

血清TNF-α在炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。LPS使GalN致敏小鼠發(fā)生得肝細(xì)胞凋亡是由釋放入血循環(huán)的TNF-α所致，進而引起白細(xì)胞介素等炎癥因子的釋放[8]。在炎癥反應(yīng)中，NO大量釋放也被人們關(guān)注和廣泛研究。NO是一種細(xì)胞信使分子和細(xì)胞毒性分子，是組織損傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強因子，能引起肝損傷。NO的這種雙重性在肝臟疾病的發(fā)生與治療中具有重要作用[10]。而TNF-α被認(rèn)為是NO合成的一個重要調(diào)節(jié)者[8]。本實驗中發(fā)現(xiàn)肝衰竭時，GalN/LPS腹腔注射1.5 h，血清TNF-α水平升高，注射8 h時肝臟NO水平也增高，而BRAF預(yù)處理可降低血清TNF-α和肝臟NO水平，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡是LPS誘導(dǎo)GalN致敏小鼠最重要的肝細(xì)胞死亡形式[7-9]。其明顯的生化特征是形成180-200 bp或者其多聚體組成的寡核苷酸片段[11]。本實驗結(jié)果顯示，腹腔注射LPS和GalN能使肝細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂形成有規(guī)則片段，而BRAF明顯降低肝細(xì)胞DNA斷裂程度，提示BRAF可抑制急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡。同時，BRAF還明顯降低LPS/GalN所致肝損傷小鼠的肝細(xì)胞DNA隨機降解，減少肝細(xì)胞DNA損傷。

綜上所述，BRAF對LPS/GalN所致小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與其提高抗氧化活性、減少炎癥反應(yīng)和抑制肝細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。

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