新型復(fù)合酶在肉雞飼料中的應(yīng)用

楊道秀， 李夏蘭， 陳培欽， 王林林

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

在家禽飼養(yǎng)上，隨著玉米供給量的缺口越來越大，人們逐漸利用小麥、大麥和燕麥等飼料原料代替玉米來飼養(yǎng)家禽，但是當(dāng)這類原料在家禽日糧中含量過多時(shí)，往往會(huì)造成飼料利用率差、家禽生長(zhǎng)不良以及環(huán)境污染等問題，這主要與高木質(zhì)纖維飼料原料中存在非淀粉多糖抗?fàn)I養(yǎng)因子有關(guān)，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)增加消化道食糜粘性，影響消化道生理形態(tài)，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，降低飼料轉(zhuǎn)化率，影響腸道菌群，對(duì)家禽的健康成長(zhǎng)造成不利的影響。消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法很多，主要包括物理方法、化學(xué)方法及生物方法。非淀粉多糖酶作為一種“綠色”添加劑，被認(rèn)為是目前消除非淀粉多糖抗?fàn)I養(yǎng)因子最有效的方法之一。飼料中的非淀粉多糖降解酶，主要包括木聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶等[1-4]。從整個(gè)世界范圍來看，飼料酶的添加率不足60%，而在中國尚不足20%，飼料酶的應(yīng)用還具有很大的上升空間。

研究結(jié)果表明，在禾本植物纖維中，反式阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，簡(jiǎn)稱FA）是含量最多的酚酸，在谷物的細(xì)胞壁中，反式FA主要是以酯鍵與半纖維素連接。半纖維素中的FA、雙FA含量及連接方式?jīng)Q定了細(xì)胞的延長(zhǎng)性、可塑性及降解性，因此斷裂FA與半纖維素連接的酯鍵是提高半纖維素降解程度的重要因素[5]。阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，簡(jiǎn)稱 FAE），是重要的細(xì)胞壁降解酶，其主要生物功能是水解多糖與FA連接的酯鍵，釋放FA[6-7]。目前國內(nèi)的發(fā)酵飼料中還未有添加FAE的報(bào)道。課題組的前期研究結(jié)果及已有報(bào)道都表明，木聚糖酶及FAE能夠共同降解植物細(xì)胞壁，同時(shí)釋放 FA和低聚木糖（xylooligosaccharide，簡(jiǎn)稱 XOS）[8-10]。 XOS 其無毒安全的特性，已成為最具潛力的動(dòng)物保健品和抗生素替代品[11]。FA具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗突變、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓、降低膽固醇和降血脂等生理功能，在日本，反式FA已應(yīng)用于食品添加劑中[12]。隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，研發(fā)高質(zhì)量的飼料已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。另外，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，抗生素的危害已經(jīng)越來越為人們所熟知，抗生素的少用或者不用是必然的發(fā)展方向。

作者主要報(bào)道了實(shí)驗(yàn)室自行發(fā)酵的FAE及商品飼料酶-溢多酶（主要含木聚糖酶（25 000 U/g）、纖維素酶（800 U/g）、甘露聚糖酶（2 000 U/g）、β-葡聚糖酶（30 000 U/g）、α-淀粉酶（300 000 U/g））酶解麥糟的工藝，及將酶解后的麥糟添加于飼料中飼喂肉雞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司產(chǎn)品；阿魏酸甲酯:華僑大學(xué)曾慶友老師自行合成；低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品、木二糖標(biāo)準(zhǔn)品:日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:上海國藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；溢多酶AF831:廣州溢多利公司產(chǎn)品；玉米及豆粕:廈門市振裕飼料有限公司產(chǎn)品；預(yù)混料:廈門百惠行科技有限公司產(chǎn)品；麥糟:廈門青島啤酒廠產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀:美國安捷倫公司產(chǎn)品；HPX-42A柱:美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；ODS-C18色譜柱:美國Thermo公司產(chǎn)品；SP-2102UV紫外可見分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；超濾膜包Vivaflow 200:北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 菌種 黑曲霉:作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.4 雞苗 青腳麻雞:廈門五顯鎮(zhèn)三秀種禽廠提供。

1.2 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件

1.2.1 種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)2 d。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 將麥糟烘干過65目篩，按m（麥糟）︰m（麥麩）=4︰1的比例，每個(gè)搪瓷盤中加入麥糟和麥麩的混合物50 g及75 mL營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，混勻，121℃滅菌30 min。每個(gè)搪瓷盤中接種12.5 ml菌液，33℃培養(yǎng)6 d。

營(yíng)養(yǎng)鹽溶液:蛋白胨 2 g，酵母粉 4 g，NaH2PO4·2H2O 1.52 g，KH2PO41 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 31.4 g，Na2HPO4·2H2O 15.6 g，用蒸餾水定容至1 L。

1.2.3 FAE粗酶液制備

1）發(fā)酵培養(yǎng)基抽提 將發(fā)酵液加入1 000 mL蒸餾水，置于33℃，180 r/min的搖床中振蕩2.5 h，取出靜置，用8層紗布過濾。

2）發(fā)酵液濃縮 在超濾膜相對(duì)分子質(zhì)量為30 000，進(jìn)口壓力為0.1 MPa，進(jìn)料速度為200 mL/min，20℃操作條件下，超濾濃縮，濃縮后的FAE酶活達(dá)到20 U/mL以上。

1.3 各種物質(zhì)測(cè)定方法

1.3.1 FA測(cè)定 按文獻(xiàn)方法分析[13]。

1.3.2 XOS測(cè)定 按文獻(xiàn)方法分析[13]。

1.3.3 還原糖測(cè)定 采用DNS法[14]。

1.4 復(fù)合酶酶解麥糟工藝研究

1.4.1 FAE添加量對(duì)麥糟酶解效果的影響 稱取5 g含水量70%的麥糟置于50 mL三角瓶中，固定溢多酶的添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.012%，分別以0、11、22、33、44、55 U 添加濃縮后的粗酶液，50 ℃， 酶解24 h。酶解后，往每個(gè)錐形瓶中加入20 mL的蒸餾水，40℃，浸提 2.5 h后，4 ℃，10 000 r/min，離心 20 min。取上清液測(cè)定FA、XOS、還原糖含量。

1.4.2 不同溫度對(duì)麥糟酶解效果的影響 添加FAE 8.8 U/g 麥糟， 控制酶解溫度為 20、30、40、50、60℃，其他操作同1.4.1。

1.4.3 不同酶解時(shí)間對(duì)麥糟酶解效果的影響 酶解溫度為 40 ℃， 控制酶解時(shí)間為 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 d，其他操作同 1.4.2。

1.4.4 不同含水量對(duì)麥糟酶解效果的影響 酶解時(shí)間為 2.5 d， 調(diào)節(jié)麥糟含水量為 30、40、50、60、70%，其他操作同1.4.3。

1.4.5 不同的酶解方式對(duì)麥糟酶解效果的影響麥糟含水量為 50%，按（1）～（5）組添加各酶液，其他操作同1.4.4。

（1）不加任何酶液，放置 60 h；（2）往麥糟中添加溢多酶0.006%，酶解24 h后，添加溢多酶0.006%（g/g 麥糟），再酶解 36 h；（3）往麥糟中添加FAE 4.4 U/g麥糟，酶解24 h后，添加FAE 4.4 U/g麥糟，再酶解 36 h；（4）往麥糟中添加FAE 8.8 U/g麥糟及溢多酶 0.012%（g/g麥糟）， 酶解 60 h；（5）往麥糟中添加0.006%溢多酶，酶解12 h后，添加FAE 4.4 U/g麥糟，酶解12 h后；加入溢多酶0.006%，酶解12 h后，最后加入FAE 4.4 U/g麥糟，酶解24 h。

1.5 復(fù)合酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

1.5.1 麥糟的處理及飼料配方

1）麥糟的處理 各組麥糟分別按如下處理:Ⅰ組，每克含水量50%的麥糟加入0.3 mL蒸餾水；Ⅱ組，每克含水量50%的麥糟加入0.3 mL蒸餾水及溢多酶0.012%；Ⅲ組，每克含水量50%的麥糟加入6.6 U FAE粗酶液；Ⅳ組，每克含水量50%的麥糟加入6.6 U FAE粗酶液及0.012%溢多酶；將上述麥糟在40℃下酶解60 h后，按肉雞日糧配方添加入飼料中。

2）飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平 肉雞日糧標(biāo)準(zhǔn)參照（NY/T33-2004雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)）中肉雞營(yíng)養(yǎng)需要，配制成粉狀飼料，粗蛋白含量為19%，代謝能為12.34 MJ/kg。

3）實(shí)驗(yàn)分組 選用15日齡青腳麻雞，稱重，選出實(shí)驗(yàn)雞，將肉雞分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8 只雞（公母混合雛），實(shí)驗(yàn)組 1、2、3、4 添加的麥糟分別按上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法處理，其他成分相同。

1.5.2 肉雞飼養(yǎng)及管理 試驗(yàn)場(chǎng)地為廈門市“仙靈旗”生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司新搭建養(yǎng)雞場(chǎng)。采用地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)，全天光照，每天飼喂3次，自由采食、飲水，定時(shí)對(duì)雞舍進(jìn)行消毒清掃（每周兩次），預(yù)飼期3 d，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為24 d，按正常肉雞免疫程序進(jìn)行免疫。在第17 d，41 d的早晨9:00空腹稱重，記錄投料量與剩料量，統(tǒng)計(jì)肉雞的死亡率，計(jì)算每只雞日增重，平均日采食量，料肉比。

1.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合酶酶解麥糟工藝

2.1.1 添加不同量FAE對(duì)酶解效果的影響 添加不同F(xiàn)AE酶量對(duì)麥糟進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖1。

圖1 添加酶量對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Influenceoftheamountofenzymeon the enzymatic hydrolysis effect

由圖1可知，隨著FAE添加量的增大，F(xiàn)A、還原糖和XOS的含量都逐漸增大。添加的FAE酶活為6.60 U/g麥糟時(shí)，酶解得到的XOS含量達(dá)到最大，為1.76 g/L；添加酶量為8.80 U/g麥糟時(shí)，F(xiàn)A含量達(dá)到最大，為0.66 mg/L。但是進(jìn)一步加大酶的添加量，F(xiàn)A及XOS的含量卻減少，一方面可能是酶液中的FA對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用，從而影響了酶對(duì)麥糟的酶解效果；同時(shí)在固定溢多酶的添加量時(shí)，只有使得FAE添加的量合適，才能使兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大。綜合考慮，選擇FAE的添加量為6.60～8.80 U/g麥糟，酶解效果較好。

2.1.2 不同溫度對(duì)酶解效果的影響 在不同溫度下進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖2。

圖2 溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Influence oftemperatureon theenzymatic hydrolysis effect

由圖2可知，隨著溫度的升高，F(xiàn)A、還原糖及XOS的質(zhì)量濃度均有所增加，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，F(xiàn)A及XOS的含量都達(dá)到最大，分別為0.52 mg/L和2.41 g/L，但是隨著溫度的繼續(xù)升高，兩者的質(zhì)量濃度都下降，主要的原因是FAE和木聚糖酶都是不耐熱的酶，當(dāng)溫度超過40℃時(shí)，酶活穩(wěn)定性迅速降低[15-16]。溫度達(dá)到50℃時(shí)，還原糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最大，為4.33 g/L，溫度繼續(xù)升高還原糖含量也下降。由此可知，復(fù)合酶最佳的酶解溫度為40℃，此時(shí)復(fù)合酶的協(xié)同效應(yīng)最佳。

2.1.3 不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 對(duì)麥糟酶解不同時(shí)間，結(jié)果如圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Influence of the time on the enzymatic hydrolysis effect

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)產(chǎn)物質(zhì)量濃度均在不斷的增加，2 d時(shí)，還原糖達(dá)到最大值，為3.72 g/L，而2 d之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸下降。FA及XOS則在2.5 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為0.63 mg/L和1.20 g/L。反應(yīng)酶解時(shí)間超過60 h，各產(chǎn)物的含量均在降低。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)A和XOS易被氧化而破壞。由于在2.5 d時(shí)，F(xiàn)A及XOS達(dá)到最高值，且還原糖含量也處于一個(gè)較高值，因此選定2.5 d為最佳的酶解時(shí)間。

2.1.4 不同水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解效果的影響 在不同水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)麥糟進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖4。

圖4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Influence of the water content on the enzymatic hydrolysis effect

由圖4可知，當(dāng)麥糟水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，酶解得到的FA、還原糖和XOS的含量都達(dá)到最大，分別為0.64 mg/L，4.20 g/L和1.95 g/L。當(dāng)麥糟水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于或者小于50%時(shí)，F(xiàn)A、XOS和還原糖質(zhì)量濃度都下降。因此選定50%為最佳的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)行酶解。

2.1.5 不同酶解方式對(duì)酶解效果的影響 采用1.4.5的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5。

圖5 不同酶解方式對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Content of each enzymatic hydrolysis product

由圖5可知，同時(shí)加入溢多酶和FAE的實(shí)驗(yàn)組XOS及還原糖質(zhì)量濃度最高，達(dá)到了5.1 g/L和3.87 g/L，F(xiàn)A質(zhì)量濃度也較高，達(dá)到0.98 mg/L，所得的FA、XOS和還原糖含量較未添加任何酶的對(duì)照組分別提高了1.88倍，50倍，19.37倍；只加入溢多酶的實(shí)驗(yàn)組FA含量最高，達(dá)到了2.25 mg/L，但XOS和還原糖質(zhì)量濃度都很低；只加入FAE的實(shí)驗(yàn)組FA、XOS和還原糖質(zhì)量濃度分別為0.84 mg/L，3.32 g/L，2.03 g/L，但是比兩種酶都加的效果差；分批加入溢多酶及FAE的各物質(zhì)含量比起同時(shí)添加的質(zhì)量濃度都低，F(xiàn)A、XOS和還原糖含量為0.91 mg/L，3.63 g/L，2.06 g/L。由此可知兩種酶協(xié)同降解麥糟比單獨(dú)添加，降解的效果更為顯著，多酶協(xié)同降解麥糟具有更大的優(yōu)越性，兩種酶同時(shí)添加的效果又比分批添加的效果要好。

2.2 復(fù)合酶對(duì)肉雞死亡率的影響 將按5.2.4.1處理后的麥糟，以7%的比例添加入肉雞基礎(chǔ)日糧中，肉雞飼養(yǎng)成活率結(jié)果如表1。飼喂全程中，飼料中未添加任何的抗生素及其他的藥，由表1可知各組雞的病死亡率均為0，差異不顯著（P<0.05），病死亡率中并未體現(xiàn)出（溢多酶+FAE）組抗病的優(yōu)勢(shì)。這可能與新建場(chǎng)地衛(wèi)生條件好，通風(fēng)，未遇到瘟病有關(guān)。

表1 復(fù)合酶對(duì)肉雞成活率的影響Tab.1 Effect of compound enzyme on survival rate of broiler

2.3 復(fù)合酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

按1.5.2進(jìn)行肉雞飼養(yǎng)，飼養(yǎng)結(jié)果如表2。從表2可知，與對(duì)照組相比，溢多酶組和（FAE+溢多酶）組均能提高肉雞日增重，分別提高了0.78%，4.37%，但是差異不顯著。而溢多酶組、FAE組和（FAE+溢多酶）組均有降低日采食量的趨勢(shì)，分別降低了3.28%，4.83%，3.51%，但是差異不顯著（P﹥0.05）。（FAE+溢多酶）組對(duì)降低料肉比具有極顯著的作用（P<0.01），降低了7.63%；而添加FAE組及溢多酶組均能降低料肉比，分別降低了3.25%、4.01%，但是差異不顯著（P﹥0.05）。

表2 復(fù)合酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響Tab.2 Influence of compound enzyme on the production performance of broiler

Yu等[17]報(bào)道了將FAE、木聚糖酶、纖維素酶及β-葡萄糖酶共同作用，燕麥的消化性比不加FAE提高了79%。Bartolome等[5]把來自黑曲霉的FAE或熒光假單胞桿菌的FAE與木聚糖酶共同作用于大麥和小麥的細(xì)胞壁，其游離的FA釋放量提高了2-6倍。但單獨(dú)使用FAE降解植物細(xì)胞壁，降解率也是較低的。Topakas等[18]報(bào)道，F(xiàn)AE與木聚糖酶同時(shí)作用從植物細(xì)胞壁中釋放的FA量是僅木聚糖酶單獨(dú)作用時(shí)的6.3倍。作者主要是在飼料中同時(shí)添加溢多酶和FAE，二者對(duì)木質(zhì)纖維的降解具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解提高飼料的飼用效率，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，同時(shí)產(chǎn)生FA及XOS也具有生理活性。

3 結(jié)語

1）麥糟酶解工藝最佳酶解條件為:時(shí)間2.5 d，操作溫度40℃，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，添加酶量為6.6～8.8 U/g麥糟。同時(shí)添加FAE和溢多酶，對(duì)麥糟的酶解效果較好，所得的FA、XOS和還原糖質(zhì)量濃度較未添加酶的實(shí)驗(yàn)組分別提高了1.88倍，50倍，19.37倍。

2）FAE及溢多酶均能夠促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)，但效果不顯著，而同時(shí)添加FAE及溢多酶組能夠顯著促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)，日增重提高4.37%，料肉比降低7.63%。

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