分子病理學(xué)在骨腫瘤診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

許 猛 綜述 王 巖 審校

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

隨著腫瘤遺傳學(xué)的進(jìn)步，特異基因的改變已經(jīng)在病理實(shí)驗(yàn)室的日常診斷中得以應(yīng)用。因此，分子診斷在骨腫瘤的分型中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。研究表明，所有尤文氏肉瘤和近70%的低分化動(dòng)脈瘤樣骨囊腫都有染色體易位，包括EWSR1基因或USP6(TRE17)基因等。而對(duì)于骨肉瘤和高分化軟骨肉瘤，基因組的不穩(wěn)定和復(fù)雜基因組型的參與也是導(dǎo)致發(fā)病的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)已被證實(shí)的前列腺癌中基因融合的高發(fā)生率(79%)啟示在骨腫瘤中存在更多隱性染色體失常[1]。最近確定了兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜融合產(chǎn)物：間葉軟骨肉瘤HEY1-NCOA2融合基因； 上皮樣血管內(nèi)皮瘤中t(1；3)(p36；q25)易位導(dǎo)致的WWTR1-CAMTA1融合，包括骨[2-5]。本綜述將介紹多種用于探索骨腫瘤基因改變的技術(shù)，并評(píng)論一些現(xiàn)存的骨腫瘤不同基因亞型的分型標(biāo)準(zhǔn)。

1 檢測(cè)細(xì)胞遺傳學(xué)變異的分子技術(shù)

1.1 傳統(tǒng)顯帶和多色熒光原位雜交技術(shù) 依賴增殖細(xì)胞中期技術(shù)，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究曾是探索復(fù)雜染色體改變的重要探索工具。人染色體核型分析為腫瘤相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變提供了全基因掃描。這些試驗(yàn)適用于探索未知的遺傳物質(zhì)改變，這些改變轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)了特征識(shí)別以及腫瘤相關(guān)染色體重排。例如復(fù)雜易位已被用于標(biāo)示斷點(diǎn)跨越基因。以細(xì)胞中期為基礎(chǔ)的人類染色體核型分析有兩個(gè)主要的局限性： 1)對(duì)有活力的分裂細(xì)胞的依賴； 2)解決的問(wèn)題有限。在一些臨床環(huán)境下，新鮮有活力的標(biāo)本是不可用于試驗(yàn)的，這些就阻礙了染色體核型分析。對(duì)于大多數(shù)的實(shí)性腫瘤，染色體的復(fù)雜性是不斷改變的，細(xì)胞中期染色體的質(zhì)量較低也阻礙了相關(guān)染色體片段的識(shí)別。最新研究顯示，在預(yù)處理切除標(biāo)本不可用的情況下，培養(yǎng)粗針活檢標(biāo)本要優(yōu)于培養(yǎng)細(xì)針活檢標(biāo)本[6]。多色熒光原位雜交(M-FISH)人類染色體核型分析是通過(guò)應(yīng)用特異性全染色體著色探針組，使每個(gè)染色體都被標(biāo)記了一個(gè)特定的顏色。這種核型分析提高了染色體重排的檢測(cè)敏感性，例如，聯(lián)合二進(jìn)制比率標(biāo)簽免疫熒光原位雜交(COBRA-FISH)核型分析[7]。然而，由于價(jià)格昂貴，而且需要特殊材料，這些試驗(yàn)未被廣泛使用。從診斷學(xué)的角度，多數(shù)已被識(shí)別的易位類型的特異性診斷試驗(yàn)(FISH和RT-PCR，詳見(jiàn)后述)已經(jīng)得到了發(fā)展。這些診斷試驗(yàn)有著很高的敏感性和特異性，并且可以在現(xiàn)有材料上應(yīng)用。這些診斷試驗(yàn)(FISH和RT-PCR)的高選擇性排除了對(duì)結(jié)果有影響的腫瘤相關(guān)的次生改變檢測(cè)。

1.2 陣列比較基因組雜交技術(shù) 近十年，陣列比較基因組雜交技術(shù)已成為檢測(cè)基因改變(基因的延長(zhǎng)或消失)的強(qiáng)大技術(shù)。這種技術(shù)已成功用于研究先天的(種屬性的)和后天獲得(腫瘤相關(guān))基因研究。常規(guī)應(yīng)用中的一些參數(shù)，例如陣列試驗(yàn)分辨率(芯片上報(bào)告元件的數(shù)量)、樣本特性(腐敗或新鮮)、樣本純度(腫瘤細(xì)胞比例)等都很重要。已推廣的陣列平臺(tái)最初是為掃描基因改變而設(shè)計(jì)的，因此在外顯子-內(nèi)含子水平上的個(gè)體基因改變的檢測(cè)方面所提供的信息是有限的。為了彌補(bǔ)這種局限性，人們開(kāi)始應(yīng)用寡核苷酸微陣列比較基因組雜交的方法?？梢杂么朔椒z測(cè)和定位目標(biāo)基因中與外顯子大小相類似的片段改變，在后天或先天基因中都可以應(yīng)用[8-9]。這項(xiàng)技術(shù)使經(jīng)過(guò)脫鈣、甲醛固定、石蠟包埋骨組織的DNA萃取物的分析成為可能[10]。陣列比較基因組雜交技術(shù)被寄希望于可直接應(yīng)用于診斷，對(duì)于拷貝數(shù)改變的檢測(cè)，尤其是當(dāng)包括多對(duì)基因座或變化基因的長(zhǎng)度可變時(shí)，陣列比較基因組雜交技術(shù)會(huì)優(yōu)于FISH技術(shù)。已經(jīng)證實(shí)CDKN2A/2B區(qū)域純合子缺失使各型腫瘤的預(yù)后都較差，而在實(shí)例中，常規(guī)FISH探針組檢測(cè)顯示出相反的結(jié)果。假陰性結(jié)果或許是由FISH探針覆蓋了部分基因區(qū)域的微缺失造成的。由于這些微缺失(5~10 kb)會(huì)比實(shí)際的探針(90~150 kb)小，因此在這種方法下，微缺失仍檢測(cè)不到。其他技術(shù)，如arrayCGH或多重連接依賴式擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)已可應(yīng)用于檢測(cè)微缺失[11-12]。這些檢測(cè)方法已在先天基因(一般的微缺失和重復(fù)綜合征基因區(qū)域)中體現(xiàn)了優(yōu)越性。另外，arrayCGH不能用于檢測(cè)平衡易位基因。

2 易位檢測(cè)

2.1 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)FISH可以在探針覆蓋斷點(diǎn)或與斷點(diǎn)側(cè)面相接的情況下識(shí)別特異性易位。易位斷點(diǎn)則使區(qū)別標(biāo)記探針組(以紅綠常見(jiàn))顯現(xiàn)出了不同顏色。如果可以得到甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本，那么FISH就是最佳選擇。FISH最大的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它可以檢測(cè)出非分裂相(細(xì)胞間期)細(xì)胞胞核內(nèi)的染色體易位，這種細(xì)胞可來(lái)源于新鮮、冰凍或甲醛固定石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本。同時(shí)，F(xiàn)ISH也可用于僅有甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本的檢測(cè)。然而，F(xiàn)ISH在石蠟包埋標(biāo)本上并不是屢試不爽的，甚至?xí)?，尤其是在?biāo)本被甲酸或醋酸脫鈣的情況下。FISH對(duì)雜質(zhì)的敏感性較RT-PCR差。用分裂FISH探針組做的診斷試驗(yàn)不能顯示易位基因的原始位置。這或許與含有EWSR1基因的腫瘤組織有很大的相關(guān)性。這個(gè)位點(diǎn)的出現(xiàn)是偶然的，并且與臨床表現(xiàn)不典型的骨腫瘤、軟組織腫瘤多樣性有關(guān)系。為了找出易位基因的準(zhǔn)確易位點(diǎn)，還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行附加試驗(yàn)(協(xié)同定位探針組或下文介紹的在RT-PCR基礎(chǔ)上的試驗(yàn))。同時(shí)，F(xiàn)ISH試驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)從組織學(xué)和免疫組化的角度進(jìn)行解釋。

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase-PCR，RTPCR) 當(dāng)運(yùn)用新鮮冰凍標(biāo)本時(shí)，RT-PCR是首選試驗(yàn)。RTPCR可用于大多數(shù)易位形成的可轉(zhuǎn)錄嵌合基因的檢測(cè)。對(duì)于RT-PCR來(lái)說(shuō)，RNA是必要的，且可以從冰凍腫瘤標(biāo)本中分離出來(lái)。從甲醛固定石蠟包埋的骨腫瘤組織標(biāo)本中分離RNA的過(guò)程會(huì)受到脫鈣過(guò)程的嚴(yán)重影響，因此可用冷凍標(biāo)本。這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其只需很少一部分組織材料，使得極少量的活體組織切片和抽取物都可用。還應(yīng)當(dāng)注意到融合基因的多樣性，例如，尤文氏肉瘤有18種不同的嵌合基因轉(zhuǎn)錄物被描述為EWSR1-FLI1，這些都應(yīng)當(dāng)在設(shè)計(jì)引物時(shí)加以考慮。檢測(cè)產(chǎn)物定序需要在外顯子水平識(shí)別易位基因。RT-PCR會(huì)遺漏新的或很少出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

2.3 突變檢測(cè) 基因中核苷酸置換的檢測(cè)方法取決于核苷酸置換是否具有復(fù)雜性、特異性，還是散在分布于編碼序列的全長(zhǎng)。檢測(cè)一個(gè)變異序列的最直接方法就是熱點(diǎn)突變，熱點(diǎn)突變主要是用來(lái)篩選致癌基因中單核苷酸替代物。這些突變通過(guò)一種顯性機(jī)制激活基因，因此其在變異中的作用是有限的。最近報(bào)道的軟骨肉瘤IDH1熱點(diǎn)突變，即為一含有很少核苷酸替代物的基因，但是這些替代物很可能就是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)子[13-14]。特異的核苷酸置換可被強(qiáng)大且敏感性極高的方法檢測(cè)出來(lái)，這些方法可檢測(cè)出被非腫瘤組織(如基質(zhì)或炎性浸潤(rùn))嚴(yán)重污染的標(biāo)本中的單個(gè)核苷酸置換。這些方法包括： 水解探針實(shí)時(shí)PCR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)，以及分光儀和斯卡帕基因分型[15-17]。每種方法致力于檢測(cè)一個(gè)既定核苷酸替代物或小基因缺失、插入基因。

抑癌基因失活的篩查通常需要非常復(fù)雜的程序(包括掃描完整基因序列)，這是由于熱點(diǎn)突變不是頻繁發(fā)生的。對(duì)于某些基因，熱點(diǎn)區(qū)域已被確定，比如TP53。這個(gè)所謂的“基因組衛(wèi)士”通常在外顯子5-外顯子8的區(qū)域突變。外顯子熱點(diǎn)突變檢測(cè)的失敗使得剩余編碼序列的篩查成為必需。預(yù)篩選可以用來(lái)識(shí)別序列變異的存在。當(dāng)下選用高分辨率溶解曲線分析法[15]。一旦一個(gè)序列變異被識(shí)別，其精確序列就可被桑格雙脫氧測(cè)序法測(cè)出。桑格測(cè)序法的敏感度不及前面所述的方法，而且必須確保腫瘤組織未受到非腫瘤細(xì)胞的嚴(yán)重污染。顯微切割使腫瘤細(xì)胞富集是必要的，或者可以使用新一代的測(cè)序技術(shù)，尤其是在很多樣本需要篩檢的時(shí)候。

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