腦缺血損傷后Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的機制

閆曉英，姜亞磊，狄 烊，孟天嬌綜述，金 宏，齊 玲審校

(吉林醫(yī)藥學院：1.2010級臨床本科班，2.實驗中心，3.病理教研室，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

腦缺血損傷后Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的機制

ThemechanismofCa2+overloadinducedneuronapoptosisaftercerebralischemiainjury

閆曉英1，姜亞磊1，狄 烊1，孟天嬌1綜述，金 宏2，齊 玲3*審校

(吉林醫(yī)藥學院：1.2010級臨床本科班，2.實驗中心，3.病理教研室，吉林 吉林 132013)

腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病，缺血后會發(fā)生再灌注損傷，而神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載是導致細胞凋亡最主要的因素。Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的機制中線粒體途徑、內(nèi)質網(wǎng)途徑和核酸內(nèi)切酶途徑最為重要，本文就這三方面進行綜述。

腦缺血損傷；Ca2+超載；神經(jīng)細胞；凋亡

在這一途徑中，bcl-2家族、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等會影響凋亡的發(fā)生。bcl-2家族中bcl-2、bcl-xl等抑制凋亡，而bax、bad、bak、bik和bcl-xs等促進凋亡。bcl-2主要分布在線粒體外膜、細胞核及內(nèi)質網(wǎng)[5]。bcl-2家族對線粒體的調(diào)控作用主要體現(xiàn)在對MPTP形成的影響。目前認為MPTP的開放是引起細胞凋亡的直接原因，因此bcl-2家族對線粒體正常生理功能的維持是十分重要的。此外，ROS也可影響線粒體。研究表明，線粒體是ROS的主要來源和促凋亡作用靶點，少量ROS可能誘導MPTP開放，促進線粒體產(chǎn)生ROS，所以ROS升高既是MPTP開放的原因也是結果，它們組成了一個大的環(huán)路，導致胞內(nèi)Ca2+重新分布。另外，ROS通過影響電壓依賴性Ca2+通道、非特異性細胞膜Ca2+通透性變化和Na+-Ca2+交換、調(diào)節(jié)的產(chǎn)生從而影響Ca2+從內(nèi)質網(wǎng)釋放入線粒體。細胞內(nèi)Ca2+升高可以激活其他酶進一步增加氧自由基的水平，因此ROS可以間接產(chǎn)生更多的氧化物進一步促進線粒體內(nèi)氧化水平升高。一些文獻表明，線粒體途徑中與神經(jīng)細胞凋亡有關的因素除了Cyt c、Smac、IAP、Apaf-1及caspases之外，絲氨酸蛋白酶/線粒體絲氨酸蛋白酶抗原(High temperature requirement protein A 2，HtrA2/Omi)和核酸內(nèi)切酶(endonuclease G，Endo G)也很重要[6]。HtrA2通過可以抑制IAP和增加caspases活性，或者取決于它的絲氨酸蛋白酶活性和caspases依賴[7-8]。Endo G是一種由線粒體編碼的酶，它可以配合核酸外切酶對DNA進行破壞，最終引起細胞凋亡[9]。如果將bcl-2基因導入神經(jīng)細胞，可以減小梗死灶的面積[10]；給藥干擾bax/bcl-2的比率也可以減輕細胞凋亡[11]。因而，維持bcl-2家族蛋白的平衡可以降低神經(jīng)細胞的凋亡程度。因此，抑制這些因素會降低細胞的凋亡，繼而減輕腦缺血損傷。

綜上所述，Ca2+超載可以通過線粒體途徑引起神經(jīng)細胞凋亡，但其影響因素很多，如果能研究出避免或減少這些影響因素的藥物，保護線粒體，最終可以減輕腦缺血損傷的發(fā)生。

2 Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的內(nèi)質網(wǎng)途徑

Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的機制中除了線粒體途徑，還有內(nèi)質網(wǎng)途徑。內(nèi)質網(wǎng)對于維持細胞內(nèi)Ca2+平衡也很重要。它主要是通過應激來調(diào)節(jié)細胞凋亡。在凋亡過程中，內(nèi)質網(wǎng)途徑與線粒體途徑相似,也和bc1-2家族成員及caspases關系密切，但是它又有自己特殊的一面。

細胞內(nèi)Ca2+超載導致內(nèi)質網(wǎng)中Ca2+失衡繼而引起內(nèi)質網(wǎng)應激的出現(xiàn)，包括非折疊蛋白反應(unfoiled protein reaction，UPR)和內(nèi)質網(wǎng)超負荷反應[12]。UPR是內(nèi)質網(wǎng)介導細胞凋亡研究較多的兩個機制之一[13]。它的啟動在早期是自我保護作用，這使大部分蛋白質合成停滯，減輕內(nèi)質網(wǎng)負荷；加速內(nèi)質網(wǎng)伴侶基因、蛋白質表達，如Bip/Crp78、鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)和Grp94等協(xié)助蛋白質折疊；發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)相關降解，清除不能正確折疊的蛋白質等[14-16]，從而積極重建細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Irels、PERK和ATF6是這一過程中重要的酶類，Irels與內(nèi)質網(wǎng)應激之后信號調(diào)整及抑制蛋白翻譯相關，PERK可以使所有的蛋白質合成下調(diào)，ATF6引起內(nèi)質網(wǎng)應激元件基因啟動子區(qū)域激活CHOP等基因。CHOP可以編碼DNA損傷蛋白，對DNA直接造成損傷，引起細胞凋亡[17]；還可以與其家族中的其他轉錄因子結合，抑制基因的轉錄活性，使細胞停滯在G1/S期，使細胞生長抑制而進入凋亡狀態(tài)。Paschen等[18]研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血損傷過程中CHOP mRNA表達明顯增高。Tajivis等[19]研究也指出CHOP對腦缺血神經(jīng)細胞凋亡有調(diào)控作用。從目前對CHOP的研究來看，它上游的誘導因子已經(jīng)清楚，但是受其控制的下游分子、影響CHOP表達的因素及它如何參與細胞凋亡通路的調(diào)節(jié)還不是很清楚。

內(nèi)質網(wǎng)超負荷反應以激活轉錄因子NF-κB為主要特點，啟動多種前炎性蛋白，包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和細胞粘附分子等[2--23]的轉錄表達，它們參與腦缺血后的神經(jīng)損傷、血腦屏障功能的破壞及炎癥反應，由此對凋亡進行調(diào)控。NF-κB的激活可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)[24]。Ca2+超載與氧化應激就有密不可分的關系，由此可以猜測內(nèi)質網(wǎng)超負荷反應和細胞內(nèi)氧化應激有一定關系。

3 Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的核酸內(nèi)切酶途徑

DNA斷裂是凋亡的標志，這一過程離不開Endo G。Tominaga[25]認為，缺血導致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，升高的Ca2+首先出現(xiàn)在核內(nèi)，從而激活核酸內(nèi)切酶引起凋亡。腦缺血后神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡時，染色質DNA降解成為約180～200 bp亞單位或其倍數(shù)的DNA片段[26]。核酸內(nèi)切酶降解DNA過程與基因表達有關。文獻報道，bcl-2基因家族、ced家族、p53及c-fos、c-jun等原癌基因都對凋亡過程有一定的調(diào)控作用[27-28]。上述基因編碼的細胞蛋白酶在細胞凋亡時被激活，使caspases激活，再進一步裂解脫氧核糖核酸酶(caspase-activated deoxyribonuclease，CAD)的抑制物ICAD(對應人DFF45)，ICAD降解而使CAD激活，DNA斷裂，最終導致細胞凋亡[29]。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)凋亡過程中的DNA降解是多個核酸內(nèi)切酶共同作用的結果，所以深入研究核酸內(nèi)切酶的作用機制將對控制DNA切除修復途徑而逆轉DNA的損失起到重要的作用。

4 小 結

總之，腦缺血后Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的機制是多方面的，它可以由多個信號傳導通路同時進行的，同時可能在各個通路之間會交叉，所以治療腦缺血損傷時要注意。對腦缺血機制的研究可以對臨床腦缺血的防治起到前瞻性作用，有利于腦缺血損傷的預防及腦缺血疾病的治療。

[1] Halestrap A P，Clarke S J，Javadov S A.Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion—a target for cardioprotection[J].Cardiovasc Res，2004，61(3)：372-385.

[2] Du Chunying，F(xiàn)ang Min，Li Yucheng，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell，2000，102(1)：33-42.

[3] Li Peng，Nijhawan D，Budihardjo I，et al.Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade[J].Cell，1997，91(4)：479-489.

[4] Moldovan L，Moldovan N I.Oxygen free radicals and redox biology of organelles[J].Histochem Cell Biol，2004，122(4)：395-412.

[5] 項永生，徐 昆.凋亡與腦缺血損傷[J].暨南大學學報：自然科學與醫(yī)學版，2000，21(2)：126-130.

[6] Ravagnan L,Roumier T，Kroemer G.Mitochondria，the Killer Organelles and their Weapons[J].J Cell Physiol，2002，192(2)：131-137.

[7] Heqde R，Srinivasula S M，Zhang ZhiJia，et al.Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction[J].Biol Chem，2002，277(1)：432-438.

[8] Suzuki Y，Imai Y，Nakayama H，et al.A serine protease，HtrA2，is released from the mitochondria and interacts with XIAP，inducing cell death[J].Mol Cell，2001，8(3)：613-621.

[9] Widlak P，Li L Y，Wang Xiaodong，et al.Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates:cooperation with exonuclease and DNase I[J].Biol Chem，2001，276(51)：48404-48409.

[10] Linnik M D，Zanhos P，Geschwind M D，et al.Expression of bcl-2 from a defective herpes simplex virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia[J].Stoke，1995，26(9)：1670-1674.

[11] Niwa M，Hara A，Iwai T，et al.Expression of Bax and Bcl-2 protein in the gerbil hippocampus following transient forebrain ischemia and its modification by phencyclidine[J].Neurol Res，1997，19(6)：629-633.

[12] 楊 田.淺析內(nèi)質網(wǎng)與細胞凋亡[J].高等函授學報:自然科學版，2007，20(1)：40-42.

[13] Milhavet O，Martindale J L，Camandolas，et al.Involvement of Gadd153 in the pathogenic action of presenilin-1 mutations[J].J Neurochem，2002，83(3)：673-681.

[14] Ma Yanjun,Hendershot L M.Herp is dually regulated by both the endoplasmic reticulum stress-specific branch of the unfolded protein response and a branch that is shared with other cellular stress pathways[J].J Biol Chem，2004，279(14):13792-13799.

[15] Zong Weixing，LI Chi，Hatzivassiliou G，et al.Bax and Bak can localize to the endoplasmic reticulum to initiate apoptosis[J].J Cell Biol，2003,162(1)：59-69.

[16] Vázquez-Martínez O，Caedo-Merino R，Díaz-Muoz M，et al.Biochemical characterization，distribution and phylogenetic analysis of Drosophila melanogaster ryanodine and IP3 receptors,and thapsigargin-sensitive Ca2+ATPase[J].J Cell Sci，2003，116(12)：2483-2494.

[17] Jousse C，Bruhat A，Carraro V，et al.Inhibition of CHOP translation by a peptide encoded by an open reading frame localized in the chop 5′UTR[J].Nucleic Acids Res，2001，29(21)：4341-4351.

[18] Tajiri S，Oyadomari S，Yano S，et al.Ischemia-induced neuronal Cell death is mediated by the endoplasmic reticulum stress pathway involving CHOP[J].Cell Death Differ，2004，11(4)：403-415.

[19] Hayashi T，SaitoA，Okuno S，et al.Damage to the endoplasmic reticulum and activation of apoptotic machinery by oxidative stress in ischemic neurons[J].Cereb Blood Flow Metab，2005，25(1):41-53.

[20] Nagayama M，Niwa K，Nagayema T，et al.The cyclooxygenase-2 inhibitor NS-398 ameliorates ischemic brain injury in wild-type mice but not in mice with deletion of the inducible nitric oxide synthase gene[J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(11)：1231-1239.

[21] Koistinaho J，Koponen S，Chan P H.Expression of cyclooxygenase-2 mRNA after global ischemia is regulated by AMPA receptors and glucocorticoids[J].Stroke，1999，30(9)：1900-1906.

[22] Gasche Y，F(xiàn)ujimura M，Morita-Fujimura Y，et al.Early appearance of activated matrix metalloproteinase-9 after focal cerebral ischemia in mice：a possible role in blood-brain barrier dysfunction[J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(9)：1020-1028.

[23] Morita-fujimure Y，Morita-fujimure M，Gasche Y，et al.Overexpression of copper and zinc superoxide dismutase in transgenic mice prevents the induction and activation of matrix metalloproteinases after cold injury-induced brain trauma[J].J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(1)：130-138.

[24] Dalton T P，Shertzer H G，Puga A.Regulation of gene expression by reaction oxygen[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，1999，39：67-101.

[25] Tominaga T，Kure S,Narisawa k，et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain[J].Brain Res，1993，608(1)：21-26.

[26] 孫運娟.腦缺血與神經(jīng)細胞凋亡[J].臨床薈萃，1999，14(3)：138-140.

[27] Adams J M，Cory S.The Bcl-2 protein family：arbiters of cell survival[J].Science，1998，281(5381)：1322-1326.

[28] Beijersberqen R L，Bernards R.Cell cycle regulation by the retinoblastoma family of growth inhibitory proteins[J].Biochim Biophys Acta，1996，1287(2/3):103-120.

[29] 畢曉瑩,丁素菊.腦缺血后核酸內(nèi)切酶對細胞凋亡的作用[J].國外醫(yī)學:腦血管疾病分冊，2000，8(2)：73-74.

[30] Chen Jun，Jin Kunlin，Chen Minzhi，et al.Early detection of DNA strand breaks in the brain after transient focal ischemia:implications for the role of DNA damage in apoptosis and neuronal cell death[J].Neuro chem，1997，69(1)：232-245.

1673-2995(2013)04-0277-03

R363.1

A

1Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡的線粒體途徑

吉林省教育廳項目(2012330)；吉林醫(yī)藥學院大學生科研基金項目(201206).

閆曉英(1991-)，女(漢族)，在讀本科.

齊 玲(1974-)，女(漢族)，副教授，博士.

2013-05-06)

腦缺血損傷是指腦缺血再恢復血流后所引起的腦組織損傷，即腦缺血-再灌注損傷。缺血-再灌注損傷所導致的神經(jīng)細胞Ca2+超載是引起神經(jīng)細胞凋亡的最主要因素。腦缺血后Ca2+進入細胞內(nèi)增多，清除減少，細胞內(nèi)出現(xiàn)Ca2+超載，繼而觸發(fā)了一系列反應從而導致細胞發(fā)生凋亡。Ca2+超載引起神經(jīng)細胞凋亡主要通過線粒體途徑、內(nèi)質網(wǎng)途徑和核酸內(nèi)切酶途徑。

神經(jīng)細胞凋亡的機制十分復雜，Ca2+超載通過線粒體途徑使凋亡因子釋放到胞質中進而啟動細胞凋亡。當細胞內(nèi)Ca2+超載時，線粒體膜的通透性會隨之改變，使得線粒體通透孔(mitochondrion permeability transition pore，MPTP)開放[1]。MPTP的開放允許大分子物質通過，這樣就導致前凋亡蛋白如細胞色素c(cytochrome C，Cyt c)、黃素蛋白凋亡誘導因子、核酸內(nèi)切酶及Smac(the second mitochondrial-derived activator of caspase)蛋白等一起釋放到細胞質中。Smac是一種可以通過與凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein，IAP)結合解除其抑制作用，并協(xié)助凋亡促進因子(apoptosis protease activating factor-1，Apaf1)促進半胱氨酸蛋白酶(cysteine containing aspirate specific protease，caspase)激活的蛋白質[2]。因此，一方面Cytc與胞質中Apaf-1和caspase-9相互作用形成凋亡小體，激活caspase-9，活化的caspase-9進一步激活caspases，引起凋亡；另一方面，釋放到胞質中的Smac通過解除IAP的凋亡抑制促進caspases的級聯(lián)效應，導致細胞凋亡[3-4]。