八角蓮活性成分鑒別及其抗癌活性研究

張艷君,馮 川

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)醫(yī)療器械學(xué)校,遼寧 沈陽(yáng) 117004)

·論 著·

八角蓮活性成分鑒別及其抗癌活性研究

張艷君,馮 川

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)醫(yī)療器械學(xué)校,遼寧 沈陽(yáng) 117004)

目的對(duì)八角蓮化合物進(jìn)行分離和鑒別，測(cè)定八角蓮成分的抗癌活性。方法采用滲漉、萃取、層析、色譜等方法提取、分離、鑒別化合物，采用MTT法測(cè)定鬼臼毒素的抗癌活性。結(jié)果從中分離得到3個(gè)化合物。并運(yùn)用質(zhì)譜、核磁共振色譜等手段對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，最終確定化合物為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素。MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細(xì)胞24，48和72 h后，鬼臼毒素呈時(shí)間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論八角蓮含有4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素等化合物，其具有SGC7901細(xì)胞增殖抑制作用。

八角蓮;鬼臼毒素;SGC7901細(xì)胞增殖抑制

1 材料與方法

1.1儀器和試劑

Bruker AV 400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀;Varian prostar制備型高效液相色譜儀，CO-150型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)NBS公司),Sephadex LH-20柱層析凝膠(Pharmacia公司),DMSO(美國(guó)amresco公司),DMSO、MTT(美國(guó)Sigma公司),胎牛血清(Gibco公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclon公司)。

1.2試藥和細(xì)胞

鬼臼毒素，自制，配成相應(yīng)溶液備用。胃癌SGC 7901細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供。

1.3提取和分離

八角蓮原藥材10 kg，粉碎成粗粉，用10倍量的80%乙醇滲漉提取3次，每次24 h，合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮，得到總浸膏。浸膏用適量水溶解后分別用醋酸乙酯和正丁醇萃取，得到醋酸乙酯部分、正丁醇部分及水溶性部分。分別回收溶劑，取醋酸乙酯部分，采用了硅膠柱層析、反相中低壓層析、柱層析和HPLC等分離純化技術(shù)，從中分離得到3個(gè)化合物。

1.4鬼臼毒素抗癌活性

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC 7901細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%小牛血清的培養(yǎng)液(每100 mL含90 mL DMEM、10 mL小牛血清、0.1 g青霉素、0.1 g鏈霉素)中，于37 ℃，5% CO2，相對(duì)濕度為98%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至80%～90%細(xì)胞發(fā)生融合時(shí)，用含0.25%胰酶消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人SGC 7901細(xì)胞懸液調(diào)整為5×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入3種不同濃度鬼臼毒素(5、10、20 mg/L)，對(duì)照組不加藥，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24、48、72 h后每孔加入MTT 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm處的吸光度(A490)值，按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%

1.5統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，各組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末，mp 219-221℃。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.46(1H，d，J=3.2HZ)，2.89(2H，dd，J=3.2，1.6 HZ)，2.69(3H，m)，4.59(4H，d，J=10.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.45(8H，s)，4.53-62(11H，m)，6.56(1′H，J=2.2 HZ)，6.12(6′H，d，J=2.2 HZ)，3.66(OCH3)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.3(C1)，46.5(C2)，41.5(C3)，73.5(C4)，107.5(C5)，147.6(C6)，147.3(C7)，111.1(C8)，133.4(C9)，135.7(C10)，72.5(C11)，176.3(C12)，133.1(C1′)，107.5(C2′)，147.3(C3′)，134.3(C4′)，147.6(C5′)，112.3(C6′)，56.9(OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的4′,5′-二去甲基鬼臼毒素[5]一致,故確認(rèn)為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素(圖1)。

化合物2白色無定形粉末。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.92(2-H，s)，6.76(4-H，s)，6.78(6-H，s)，4.56(7-H，d，J=8.1 HZ)，2.66(8-H，m)，4.46(9α-H，dd，J=8.1，8.3 HZ)，4.76(9β-H，dd，J=4.5，8.5 HZ)，6.98(2′-H，d，J=3.1HZ)，6.76(5′-H，d，J=1.6 HZ)，6.86(6′-H，dd，J=1.5，8.1 HZ)，4.56(7′-H，d，J=7.8 HZ)，2.24(8′-H，m)，3.76(9′α-H，dd，J=5.1，11.2 HZ)，3.69(9′β-H，m)，3.86(3-OCH3，s)，3.86(3′-OCH3，s);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：134.5(C1)，109.8(C2)，145.5(C3)，114.3(C4)，147.5(C5)，119.6(C6)，75.6(C7)，51.1(C8)，69.4(C9)，132.7(C1′)，109.5(C2′)，147.3(C3′)，145.1(C4′)，114.5(C5′)，118.3(C6′)，83.3(C7′)，51.6(C8′)，61.3(C9′)，54.9(5-OCH3)，54.8(3′-OCH3)。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的八角蓮醇[6]一致,故確認(rèn)為八角蓮醇(圖2)。

化合物3白色晶體，mp 158-161℃，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.76(1H，d，J=3.1 HZ)，2.97(2H，dd，J=3.2，1.5 HZ)，2.71(3H，m)，4.65(4H，d，J=8.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.44(8H，s)，4.51-4.63(11H，m)，6.46(1′H，s)，6.42(6′H，s)，3.71(3′-OCH3，s)，3.72(4′-OCH3，s)，3.73(5′-OCH3，s)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.4(C1)，46.3(C2)，41.9(C3)，73.2(C4)，107.2(C5)，148.9(C6)，148.6(C7)，110.3(C8)，135.6(C9)，132.4(C10)，72.6(C11)，177.3(C12)，138.1(C1′)，109.5(C2′)，153.3(C3′)，138.3(C4′)，153.6(C5′)，109.3(C6′)，56.9(3′-OCH3)，61.5(4′-OCH3)，56.9(5′-OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的鬼臼毒素[7-8]一致,故確認(rèn)為鬼臼毒素(圖3)。

圖 1 4′,5′-二去甲基鬼臼毒素 圖 2 八角蓮醇 圖 3 鬼臼毒素

2.2MTT比色法檢測(cè)結(jié)果

不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細(xì)胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈時(shí)間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。低濃度的鬼臼毒素便對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高劑量組鬼臼毒素抑制作用更顯著，72 h后抑制率達(dá)到67.79%。

表 1 鬼臼毒素對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響(%)

與對(duì)照組相比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

鬼臼類植物是一類含有顯著生物活性物質(zhì)的藥用植物,因?yàn)槠渥饔蔑@著，所以具有悠久的應(yīng)用歷史。歷來醫(yī)家均有應(yīng)用鬼臼類植物診治疾病的記載，臨床上主要用于蛇咬傷、癰癤腫毒、跌打損傷、風(fēng)濕筋骨痛及氣管炎等癥[9-11]。

本研究對(duì)八角蓮植物的根及根莖進(jìn)行化合物的提取分離及鑒別。用10倍量的80%乙醇滲漉提取，回收溶劑后，將浸膏用適量水溶解后分別用醋酸乙酯和正丁醇萃取，醋酸乙酯部分采用了硅膠柱層析、反相中低壓層析、柱層析和HPLC等分離純化技術(shù)，從中分離得到3個(gè)化合物。并運(yùn)用質(zhì)譜、核磁共振色譜等手段對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，最終確定化合物為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素。

為探討鬼臼毒素的抗癌活性，本研究以胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞，通過自制鬼臼毒素，考察了不同濃度的鬼臼毒素對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，探討鬼臼毒素是否具有誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細(xì)胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈時(shí)間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。低濃度的鬼臼毒素便對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高劑量組鬼臼毒素抑制作用更顯著，72 h后抑制率達(dá)到67.79%。

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Theidentificationoftheactivecomponentofdysosmaversipellisanditseffectonanticanceractivity

ZHANG Yan-jun,FENG Chuan

(School of Medical Devices Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang，Liaoning Province,117004，China)

ObjectiveTo isolate and identify the active component of dysosma versipellis and determine its anticancer activity.MethodsThe percolation，solvent extraction，chromatography and gas chromatography were used to extract and identify the compound and MTT were applied to determine the anticancer activity of podophyllotoxin.ResultsThree compounds are isolated.Mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance chromatography were made to analysis the compound structure，which confirmed as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin.The MTT shows that the proliferation of SGC7901 gastric cancer cells could be inhibited by the podophyllotoxin of different dose at 24，48 and 72 h in the time and dose-dependent manner.ConclusionDysosma versipellis contains the compounds such as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin， it own inhibitory effect on proliferation of SGC7901.

dysosma versipellis;podophyllotoxin;inhibition of cell proliferation SGC7901

1673-2995(2013)04-0241-04

R284

A

張艷君(1963-)，女(漢族)，工程師，本科.

2013-04-19)

八角蓮為小檗科(Berberidaceae)八角蓮屬(Dysosma)植物八角蓮[Dysosma versipellis (Hance) M.Cheng]的干燥根及根莖，八角蓮性涼，味甘、微苦，有毒，具有清熱解毒、活血散瘀的功能[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，八角蓮具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用[3-4]。其中，鬼臼毒素(podophyllotoxin)類化合物的抗腫瘤作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)對(duì)八角蓮藥材進(jìn)行提取分離純化，對(duì)得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，同時(shí)探討鬼臼毒素的抗癌活性。