DNA主動去甲基化相關(guān)通路的研究進(jìn)展

金巧智 綜述，蔡志毅 審校

(1.溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000;2.臺州市立醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 臺州 318000)

對于DNA去甲基化的研究以往都是以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)為靶向分子，通過抑制DNMT來恢復(fù)抑癌基因的功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。去甲基化藥物就是通過抑制DNMT的活性使復(fù)制后的DNA不能再次甲基化，從而導(dǎo)致所有等位基因表現(xiàn)為去甲基化，使抑癌基因得以恢復(fù)表達(dá)，抑制腫瘤的生長。雖然去甲基化藥物的出現(xiàn)將腫瘤的治療帶到了一個(gè)新的高度，但是仍有很多問題亟待解決，比如DNA去甲基化的確切機(jī)制及其靶向特異性。目前研究發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化主要有兩種方式:一種是在原生殖細(xì)胞和早期胚胎中都可以發(fā)生的主動DNA去甲基化[1]，這一過程不依賴于DNA復(fù)制，受酶的催化，使5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)轉(zhuǎn)化為未甲基化的胞嘧啶;另一種是通過與復(fù)制相關(guān)的過程發(fā)生的被動DNA去甲基化[2]，即在DNA復(fù)制時(shí)，DNA甲基化模式的維持受到干擾，沒有保留原有甲基化模式，隨著復(fù)制的進(jìn)行，甲基化的CpG島被“稀釋”，導(dǎo)致DNA去甲基化。

盡管在很多細(xì)胞進(jìn)程中都存在DNA主動去甲基化，但是關(guān)于主動去甲基化的潛在機(jī)制仍存在很多爭論[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)DNA主動去甲基化可能涉及到的通路有6個(gè)，即5mC脫氨基化與BER偶聯(lián)通路、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)通路、5mC甲基團(tuán)脫氫通路、核苷切除修復(fù)(nucleoside resection repair，NER)通路、水解反應(yīng)直接去除甲基團(tuán)、5mC氧化去甲基化[3-5]。與這些通路相關(guān)的酶和因子有:胞嘧啶脫氨酶:AID，APOBEC1[6-7];TET 蛋白:TET1，TET2 等[8-9];延伸復(fù)合物蛋白:ELP1，ELP2等[10];堿基切除修復(fù)蛋白:RNF4，TDG 等[11-13];核苷酸切除酶:GADD45a，GADD45b[14-15];DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:DNMT3a，DNMT3b;DNA 糖基化酶:EME，DML2 等[16-17]。但其中哪個(gè)或哪些具有真正的DNA去甲基化活性尚待驗(yàn)證。本文綜述最新文獻(xiàn)資料，介紹其中主要通路及其相關(guān)的酶和因子。

一、5mC脫氨基偶聯(lián)BER通路與AID蛋白

AID(activation induced deaminase)蛋白在 B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白基因的種類轉(zhuǎn)變重組(species change restructuring，CSR)和體細(xì)胞超突變(somatic mutations，SHM)中發(fā)揮重要作用[18]，能使5mC脫氨基變?yōu)門，造成T/G錯(cuò)配，在卵母細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)、胚胎生殖細(xì)胞和原生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGC)的DNA去甲基化中也起重要作用，AID的缺失會阻遏DNA去甲基化。利用重亞硫酸鹽新一代測序技術(shù)繪制的13.5日齡PGC的全基因組甲基化圖譜，證明活化誘導(dǎo)AID的缺失會影響PGC 全基因組甲基化消除[6]。Popp 等[6]研究還發(fā)現(xiàn)，AID完成對5mC的脫氨基修飾后，留下的T/G錯(cuò)配可激活DNA修復(fù)通路，其中倍受關(guān)注的是AID與BER偶聯(lián)的DNA去甲基化通路。Hajkova等[13]也發(fā)現(xiàn)PGC全基因組去甲基化過程可激活DNA修復(fù)通路，他們在小鼠PGC中發(fā)現(xiàn)，XRCC-1和 PARP-1與染色質(zhì)結(jié)合的同時(shí)，DNA甲基化水平降低，表明正在發(fā)生去甲基化的PGC中有BER通路參與。BER通路中發(fā)揮部分作用的DNA糖苷酶可以逆轉(zhuǎn)AID的脫氨基作用導(dǎo)致T/G錯(cuò)配。在斑馬魚中AID和甲基化CpG結(jié)合蛋白家族成員中的MBD4一起，促進(jìn)DNA去甲基化[12]。據(jù)報(bào)道，Aid-/-小鼠PGC基因組甲基化水平高于野生型，Aid基因缺失主要影響內(nèi)含子、轉(zhuǎn)座子以及部分外顯子的去甲基化，而啟動子甲基化水平與野生型相當(dāng)。但是Aid-/-的PGC中仍發(fā)生一定程度的去甲基化[19]，暗示AID對整個(gè)基因組的去甲基化作用是有限的?；蛘哒f其促進(jìn)去甲基化作用可能存在序列特異性。最近的研究報(bào)道，AID缺失會干擾總DNA的去甲基化，在ES+體細(xì)胞聚合物中，AID參與像 OCT4或NANOG這些多潛能細(xì)胞的去甲基化[7]。利用RNA干擾技術(shù)阻斷人類成纖維細(xì)胞和小鼠ESC中的AID后，兩者融合形成的異核體中多能性相關(guān)基因Oct4和Nanog的啟動子處于甲基化狀態(tài)，使Oct4和Nanog基因表達(dá)受到限制[20]，表明AID可能在體細(xì)胞DNA甲基化再編程及其多能性誘導(dǎo)過程中起重要作用。

二、BER 通路與 TET、Apobec 1、TDG蛋白

TET(ten eleven translocation)蛋白被認(rèn)為是一種候選DNA去甲基化酶，Tahiliani等[8]用JBP(base J binding protein，存在于錐體蟲屬中，可對胸腺嘧啶進(jìn)行羥基化修飾)家族蛋白的酶活結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了反復(fù)的序列比對，找到了TET1、TET2和TET3。TET1是一種Fe2+依賴性的5mC加氧酶，并預(yù)測人類TET1蛋白具有5mC羥基化酶活性，能促使DNA上的5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)。他們通過薄層色譜法(TLC)、質(zhì)譜分析法(MC)等一系列生化實(shí)驗(yàn)以及過表達(dá)，RNAi等細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其預(yù)測。同期發(fā)表的另一篇文章[21]在機(jī)體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了5hmC的存在，從側(cè)面也印證了這一研究。在小鼠上做的進(jìn)一步研究已經(jīng)證實(shí)3種TET家族成員能夠使5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC，通過對敲除TET1的小鼠的研究證實(shí)，這種蛋白在早期胚胎發(fā)育過程中，對于保持胚胎干細(xì)胞的多能性具有潛在的作用[9]。在體外培養(yǎng)的小鼠 ESC中發(fā)現(xiàn)，TET1通過將5mC轉(zhuǎn)化為5hmC調(diào)節(jié)DNA甲基化水平，使Nanog基因保持激活狀態(tài)，從而維持ESC的多能性[15]。同樣，在人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞系和小鼠ESC中也發(fā)現(xiàn)TET1的5mC修飾作用，并且發(fā)現(xiàn)敲除TET1能導(dǎo)致5hmC水平下降[14]。在胚胎干細(xì)胞中，TET使5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC的生物學(xué)過程首先發(fā)生在主動轉(zhuǎn)錄基因，Tet1蛋白不僅能調(diào)控富含CpG啟動子區(qū)的DNA甲基化水平，而且能促進(jìn)干細(xì)胞中與多能性相關(guān)的因子的轉(zhuǎn)錄，以及參與多梳靶向(具有靶向作用的大分子復(fù)合物)的發(fā)育調(diào)控因子的抑制，而且與基因的轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)[22-23]。在最新的研究中，宋洪軍等[24]將小鼠分為電休克治療(electric shock therapy，ECT)樣電刺激處理組及對照組，然后利用遺傳工具結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對來自這些小鼠大腦組織細(xì)胞中的基因組微小區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，隨后對這些DNA片段上胞嘧啶狀態(tài)進(jìn)行了比較分析。利用先進(jìn)的基因測序技術(shù)，研究人員分析了2組小鼠腦細(xì)胞中DNA特殊區(qū)域的胞嘧啶甲基化狀態(tài)(包括普通胞嘧啶、甲基化胞嘧啶、羥甲基化胞嘧啶)。研究結(jié)果表明ECT確實(shí)誘導(dǎo)了去甲基化，而TET1是這一過程的關(guān)鍵性作用因子，同時(shí)提到了另一種脫氨酶Apobec1(apolipoprotein B RNA-editing catalytic component-1)，TET1 使5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC，而Apobec1則進(jìn)一步促使羥基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?，同時(shí)發(fā)現(xiàn)5hmC的去甲基化需要BER通路的參與。而徐國良等[25]研究發(fā)現(xiàn)，無論是體外的細(xì)胞還是培養(yǎng)的細(xì)胞，DNA第5種堿基5mC、第6種堿基5hmC可以進(jìn)一步形成第7種堿基 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。這種新的修飾堿基會被自動識別出來，并依靠胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase，TDG)從基因組中切除，再通過DNA的剪切修復(fù)，替換為沒有修飾成分的胞嘧啶。為了弄清5hmC的去甲基化機(jī)制，Wossidlo等[26]將小鼠合子中的父源基因組DNA主動去甲基化現(xiàn)象與DNA修復(fù)機(jī)制聯(lián)系到了一起，通過觀察合子內(nèi)甲基化水平的動態(tài)變化以及DNA復(fù)制、DNA斷裂、DNA修復(fù)發(fā)生的精確時(shí)間，發(fā)現(xiàn)DNA鏈斷裂標(biāo)記(γH2A.X)、BER通路標(biāo)記(PARP-1)和DNA甲基化水平的降低都在合子雄性原核形成的第三個(gè)階段(PN3期)開始出現(xiàn)，暗示合子中的DNA主動去甲基化與BER通路存在聯(lián)系。在PN3期雄性原核中能檢測到XRCC-1(BER通路核心組件)和PARP-1信號，但幾乎檢測不到ERCC1(NER通路核心組件)和XPA(NER通路組件之一)信號[13]，進(jìn)一步說明合子中DNA主動去甲基化的DNA修復(fù)可能通過BER通路。

三、5mC中的甲基脫氫通路與ELP3蛋白

ELP(elongator complex protein)蛋白是1999年Otero等[27]在研究酵母RNA聚合酶Ⅱ(RNA PⅡ)復(fù)合物各成分的性質(zhì)時(shí)，從酵母染色質(zhì)的RNA PⅡ/DNA/RNA三元復(fù)合物中分離得到的，它與轉(zhuǎn)錄延伸過程中磷酸化的RNA PⅡ結(jié)合。ELP由6個(gè)亞基組成的2個(gè)亞單位構(gòu)成，Elp1/2/3構(gòu)成較大的亞單位，Elp4/5/6構(gòu)成較小的亞單位。Elp3亞基是中心亞基，起著將其他亞基組裝成整體的作用[28]。Elp亞基中有一個(gè)鐵硫簇的結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine，SAM)，這在去甲基化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ELP3蛋白在合子DNA主動去甲基化過程中起重要作用[3，10]，被敲除后阻礙合子中父源DNA的去甲基化[10]。在受精前向MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)注射編碼ELP3結(jié)構(gòu)域突變體mRNA，發(fā)現(xiàn)ELP3中含有鐵硫簇的S-腺苷甲硫氨酸殘基結(jié)構(gòu)域突變可阻止父源DNA的去甲基化[10]。生物信息學(xué)證據(jù)表明，SAM殘基超家族蛋白催化包括DNA甲基化在內(nèi)的許多反應(yīng)[29]。ELP3的 SAM殘基結(jié)構(gòu)域可利用SAM產(chǎn)生5'-脫氧腺苷殘基，使5mC甲基團(tuán)脫氫，進(jìn)而發(fā)生一系列生化反應(yīng)而生成5hmC并最終轉(zhuǎn)化為未甲基化胞嘧啶[3]。然而，由ELP3介導(dǎo)的去甲基化尚缺乏直接證據(jù)，它所催化的去甲基化具體生化反應(yīng)也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

四、NER通路與Gadd45a蛋白

Gadd45(Growth arrest DNA-damage-inducible protein 45)蛋白家族包括 Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g，它們的序列高度保守并且是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子[30]。其中，Gadd45a在細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[31-32]。Barreto等[33]研究發(fā)現(xiàn) Gadd45a 在非洲爪蟾蜍卵母細(xì)胞的主動去甲基化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，Rai等[12]在對斑馬魚受精卵的研究中也發(fā)現(xiàn)Gadd45a能促進(jìn)DNA的主動去甲基化。最新的一項(xiàng)研究揭示了成骨干細(xì)胞終端分化中存在DNA主動去甲基化調(diào)控方式，而且Gadd45a在該過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[34]。該研究以成骨分化間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯堪l(fā)現(xiàn)，Gadd45a介導(dǎo)的成骨基因去甲基化調(diào)控主要發(fā)生于啟動子的中等密度區(qū)，而非通常認(rèn)為的具有較高密度的CpG島[35-36]，而且Gadd45a介導(dǎo)的主動去甲基化主要發(fā)生在若干特定的CpG位點(diǎn)上，如Dlx5的-913和-800、Runx2的-820和-808、BGP的-1003以及Osterix的 -727和-632 CpG位點(diǎn)，提出在DNA主動去甲基化過程中可能存在一種位點(diǎn)特異性去甲基化機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)，Gadd45a通過與啟動子直接結(jié)合而發(fā)揮作用，它對成骨基因的主動去甲基化調(diào)控可能是通過NER途徑實(shí)現(xiàn)的。

五、展望

以TET家族為代表的5mC羥化酶的發(fā)現(xiàn)，使TET在DNA去甲基化的過程中發(fā)揮的作用受到越來越多的關(guān)注。已經(jīng)知道TET1催化5mC羥基化是DNA主動去甲基化的關(guān)鍵一步，去甲基化是由5mC的修飾開始，而不是直接的移除其甲基團(tuán)。雖然很多的研究表明在動植物中廣泛的存在DNA主動去甲基化，但其潛在的分子機(jī)制還有待繼續(xù)深入研究。

在研究DNA去甲基化機(jī)制的同時(shí)，DNA主動去甲基化的靶向作用機(jī)制也開始受到了關(guān)注[1]。有研究結(jié)果顯示，DNMT抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)在治療腫瘤的同時(shí)也增加了腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性[37]。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和2R-75-1中加入5-aza-CdR后，腫瘤細(xì)胞增殖減低、抑癌基因RSSSF1A表達(dá)恢復(fù)、細(xì)胞周期改變、裸鼠體內(nèi)腫瘤生長速度減慢。但同時(shí)也誘導(dǎo)了6種原浸潤、原轉(zhuǎn)移基因，使它們的啟動子發(fā)生去甲基化，產(chǎn)生基因不穩(wěn)定性。因此，再深入研究DNA去甲基化機(jī)制的同時(shí)，如何使去甲基化更具特異性和靶向性，盡可能降低對其他方面的負(fù)面影響也將成為今后去甲基化研究的目標(biāo)。

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