液體MGIT培養(yǎng)法在結核分枝桿菌檢測中的應用評估

吳學兵，陸 彬，桂曉虹，江 淵，張國英，王 宏

(1.上海市第七人民醫(yī)院檢驗科，上海 200137;2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201600;3.上海市疾病預防控制中心結核病防治科，上海200336)

目前結核病的實驗診斷方法以涂片抗酸染色和結核分枝桿菌培養(yǎng)為主，在結核分枝桿菌培養(yǎng)中，以固體羅氏(L-J)培養(yǎng)法為經典方法，但需4～8周時間，而液體培養(yǎng)中多需要昂貴的設備，不適合在基層醫(yī)院推廣，液體分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)培養(yǎng)法對結核分枝桿菌培養(yǎng)具有操作簡單、方便易行、報陽時間比固體L-J培養(yǎng)法短等優(yōu)點，本研究將液體MGIT培養(yǎng)法與固體L-J培養(yǎng)法進行比較，以評估液體MGIT培養(yǎng)法在結核病診斷中的應用。

材料和方法

一、材料

1.標本來源 收集2010年11月至2011年8月上海松江區(qū)中心醫(yī)院肺結核門診和住院的疑似或確診后治療復診的患者痰標本共1598例，其中828例為疑似新發(fā)患者標本，770例為已確診后復診的患者標本，結核病是根據衛(wèi)生部發(fā)布的 WS288-2008《肺結核診斷標準》[1]中臨床癥狀、體征及胸部影像學檢查等確診。

2.儀器與試劑 抗酸染液購自珠海BASO公司，固體L-J培養(yǎng)基為上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產的中性改良羅氏培養(yǎng)基，液體MGIT培養(yǎng)基為美國BD公司生產的MGIT培養(yǎng)管(手工法)，以上試劑均為上海市疾病預防控制中心(CDC)結核病防治科統(tǒng)一提供。美國BD公司BACTEC MicroMGIT熒光判讀儀、Eppendorf Centrfuge 5810型離心機。

二、方法

1.標本留取 囑患者留晨、晚間痰和即時痰3次，涂片染色操作和質控方法參照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]及文獻報道[3]進行，涂片統(tǒng)計陰、陽性時以患者3次送檢中有1次痰檢陽性即統(tǒng)計為陽性。

2.標本前處理和分離培養(yǎng) 無菌取痰標本1～2 mL(送3次痰標本將其混和后再取)于50 mL帶蓋的尖底離心管中，先用1～2倍體積N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法(NaOH-NALC)前處理液消化15～20 min，加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)至 50 mL，3000×g 離心 15 min，再棄上清，沉淀用pH值6.8 PBS 0.7 mL制備成懸濁液，取0.1 mL沉淀物接種到中性固體L-J培養(yǎng)基中，同時取0.5 mL接種MGIT中，于標本接種MGIT前在每一個MGIT中加入0.5 mL營養(yǎng)添加劑(OADC)和0.1 mL以無菌蒸餾水溶解的雜菌抑制劑(PANTA)，2種培養(yǎng)管均置37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，次日起開始觀察菌生長情況，L-J培養(yǎng)用肉眼觀察，液體培養(yǎng)用手工MGIT熒光讀數儀進行判讀，2種方法所有陰性培養(yǎng)管繼續(xù)進行培養(yǎng)和讀管持續(xù)8周(判讀儀判讀時持續(xù)讀管6周)。MGIT陰性培養(yǎng)管應在丟棄前再觀察管內的混濁或小顆粒的情況，檢測出的陽性培養(yǎng)均涂片抗酸染色確認。

3.質控 涂片染色每周用上海市臨床檢驗中心抗酸染色陰陽性片做平行檢測合格，室間質評定期隨機涂片抽樣送上海市CDC參加盲法復檢評估，各項指標合格。固體L-J培養(yǎng)法和液體MGIT培養(yǎng)法所有陽性培養(yǎng)標本均送上海市CDC結核病防治科確認為結核分枝桿菌復合群。

三、統(tǒng)計學方法

采用PEMS 3.1醫(yī)學統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、2種培養(yǎng)法對分枝桿菌培養(yǎng)報陽時間

對疑似新發(fā)230株、復診58株確診的患者來自同一痰標本均出現(xiàn)培養(yǎng)陽性，其報陽時間進行比較，在疑似新發(fā)230例中，液體MGIT培養(yǎng)法報陽時間為 4 ～22 d[(13.63 ±7.14)d]，明顯低于固體 L-J培養(yǎng)法[17～40 d，(28.67 ±10.04)d，P＜0.05)]。在復診的58例中液體MGIT培養(yǎng)法報陽時間為12 ～33 d[(22.94 ±9.55)d]，明顯低于固體L-J培養(yǎng)法[18～40 d，(28.53±10.40)d，P＜0.05)]，液體MGIT培養(yǎng)法中疑似新發(fā)和復診患者的報陽天數差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，固體L-J培養(yǎng)法中疑似新發(fā)和復診患者的報陽天數差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

二、涂片及2種培養(yǎng)法對分枝桿菌陽性率和2種培養(yǎng)法的污染率

對1598例痰標本同時進行涂片抗酸染色法、液體MGIT培養(yǎng)法和固體L-J培養(yǎng)法檢測，在陽性率上，液體MGIT培養(yǎng)法的總陽性率21.09%(337/1598)、疑似新發(fā)陽性率32.00%(265/828)、確診治療后復診痰培養(yǎng)陽性率9.30%(72/770)，與固體L-J培養(yǎng)法總陽性率 10.51%(168/1598)、疑似新發(fā)陽性率 17.90%(148/828)，確診治療后復診痰培養(yǎng)陽性率2.60%(20/770)以及和涂片抗酸染色法總陽性率 10.63%(170/1598)、疑似新發(fā)陽性率14.80%(123/828)比較均高(P＜0.05)，但在確診治療后復診患者痰液體MGIT培養(yǎng)法陽性率與涂片抗酸染色法陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);另一方面，固體L-J培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法陽性率比較，除確診治療后復診痰涂片抗酸染色法陽性率6.1%(47/770)比固體L-J培養(yǎng)法2.60%(20/770)高(P＜0.05)外，其余的固體L-J培養(yǎng) 法和涂片抗酸染色陽性率在總陽性率、疑似新發(fā)陽性率上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在液體MGIT培養(yǎng)法和固體L-J培養(yǎng)法污染率上，MGIT培養(yǎng)法污染率為6.57%(105/1598)，比固體 L-J培養(yǎng)法污染率[4.00%(64/1598)]高(P ＜0.05)。

討 論

目前結核病的傳播和治療是一個世界性的難題，備受關注，結核分枝桿菌培養(yǎng)是結核病診斷金標準，但傳統(tǒng)的實驗室診斷如涂片抗酸染色法存在陽性率低的問題，我們之前研究初次確診的結核病患者痰涂片抗酸染色法陽性率為39.4%[3]，且不能確診和做藥物敏感性試驗，固體L-J培養(yǎng)法痰細菌報陽時間需4～8周，陽性率為44.3%，嚴重影響了患者的診斷和治療;液體培養(yǎng)瓶(儀器法)需要昂貴的設備，不宜在基層醫(yī)院推廣，而液體MGIT培養(yǎng)法原理為MGIT底部包埋有熒光物質，熒光物質會隨著管內氧含量的變化而發(fā)生反應，若有分枝桿菌在MGIT內生長消耗氧，管內熒光物質就會被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，只需用長波紫外燈或用手工MGIT熒光讀數儀判讀，操作簡單、方便易行。

本研究發(fā)現(xiàn)，疑似新發(fā)患者標本液體MGIT培養(yǎng)法報陽時間為(13.63±7.14)d，固體 L-J培養(yǎng)法報陽時間為(28.67±10.04)d，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);復診患者標本液體MGIT培養(yǎng)法報陽時間為(22.94 ±9.55)d，與固體 L-J培養(yǎng)法[(28.53 ±10.40)d]差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，雖復診患者經治療后細菌生長慢且難，液體MGIT培養(yǎng)法在復診患者報陽時間上比固體L-J培養(yǎng)法平均可縮短1周左右。

從3種方法檢出結核分枝桿菌的陽性率上可以看出，在無論疑似新發(fā)和復診患者的陽性率對比上，初診液體MGIT培養(yǎng)法陽性率為32.00%(255/828)，比涂片抗酸染色法14.8%(265/828)和固體L-J培養(yǎng)法的17.9%(148/828)陽性率都高(P ＜0.05)，與文獻報道[4]基本一致，涂片抗酸染色法和固體L-J培養(yǎng)法在疑似新發(fā)患者痰培養(yǎng)中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與本實驗室之前研究[3]基本一致，但在復診的患者痰菌檢驗中，液體MGIT培養(yǎng)法陽性率為9.3%(72/770)，與涂片抗酸染色法6.1%(47/770)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與固體 L-J培養(yǎng)法的陽性率2.6%(20/770)相比較高(P ＜0.05)，其原因可能與復診患者經抗結核治療后一方面可能是無活性或活性差，如用藥后L型的形成等因素，同時菌量少，不能或難以在一般培養(yǎng)基上生長，但涂片可查見，另一方面液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和環(huán)境不一樣[5-6]，同樣顯示了液體培養(yǎng)基優(yōu)于固體L-J法，也說明了復檢患者痰標本中結核分枝桿菌的分離培養(yǎng)更適于采用液體培養(yǎng)法。

液體MGIT培養(yǎng)法污染率為6.57%(105/1598)，比固體 L-J培養(yǎng)法污染率[4.0%(64/1598)]高(P ＜0.05)，比李靜等[4]報道的 3.0%高，比國外的9.7%低[7]，在觀察和分析實際操作中降低污染率的改進環(huán)節(jié)很多，如嚴格在配制pH值8.6 PBS上或其他添加劑上注意無菌操作，在標本處理和消化上充分震蕩混勻，將黏液塊打碎，所有的加樣槍定期消毒，加樣吸頭高壓滅菌和使用一次性移液管與吸管，生物安全柜內要加強消毒措施等，同時優(yōu)化操作流程等都會在降低污染率上發(fā)揮一定的作用。

總之，液體MGIT培養(yǎng)法無論從提高陽性率、縮短報陽時間上都優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法，而且操作簡便，不需要昂貴的設備，在基層醫(yī)院易于進行操作和推廣，本研究今后將在進一步控制和降低污染率上探索出更有效的措施和辦法。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.肺結核診斷標準[S].WS288-2008，中華人民共和國衛(wèi)生部，2008.

[2]中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會.結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M].北京:中國教育文化出版社，2006:8-45.

[3]吳學兵，張 歡，陸 彬，等.253例729份新發(fā)肺結核病患者初次痰菌檢測[J].檢驗醫(yī)學，2010，25(9):682.

[4]李 靜，桂曉虹，孫 丕，等.MGIT液體培養(yǎng)基檢測分枝桿菌效果的評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34(2):111-114.

[5]胡忠義.我國結核分支桿菌L型實驗研究現(xiàn)狀與亟待解決的問題[J].中華結核和呼吸雜志，2002，25(6):583-585.

[6]黃燊德.肺結核患者結核分枝桿菌L型培養(yǎng)的臨床意義[J].熱帶醫(yī)學雜志，2006，6(5):568-569.

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