人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向分化及臨床應(yīng)用進(jìn)展

楊 雯，惠 玲，呂同德

間充質(zhì)干細(xì)胞是1974年被科學(xué)家Friedenstein等［1］首次從骨髓細(xì)胞中分離并鑒定的新型干細(xì)胞，主要存在于中胚層，是一種具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。這種細(xì)胞普遍存在于動(dòng)物骨膜、松質(zhì)骨及脂肪組織中［2］，且在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及支持造血的基質(zhì)等。其弱的免疫原性在很大程度上降低了移植物抗宿主病的發(fā)生概率，使其成為細(xì)胞組織工程與細(xì)胞水平疾病治療的一個(gè)重要來源。特別是近年隨著干細(xì)胞治療越來越廣泛地應(yīng)用于臨床研究與治療，一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源——人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanbeing mesenchymal stem cells，hUCMSCs)受到研究者普遍關(guān)注并且成為干細(xì)胞領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)［3］。hUCMSCs是存在于臍帶華通膠(Wharton's jelly)和血管周圍組織中的一種干細(xì)胞，直到2003年才被Mitchell等［4］和 Romanov 等［5］成功地從人臍帶基質(zhì)中分離出來，從此引起了研究者的廣泛關(guān)注。此類細(xì)胞外觀呈梭形或多角形，具有細(xì)胞核，可高表達(dá)CD44、CD73和CD105等細(xì)胞表面標(biāo)記，幾乎不表達(dá)CD34、CD45、CD31和HLA-DR。作為一種新型的原始干細(xì)胞，hUCMSCs與傳統(tǒng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，如較強(qiáng)的多向分化能力及在再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞組織工程中的潛在應(yīng)用。Seda等［6］報(bào)道的軟骨疾病最新治療方案探索的文章中證明了間充質(zhì)干細(xì)胞作為軟骨組織工程細(xì)胞在這一類疾病的治愈過程中發(fā)揮著很大作用，特別是hUCMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞定向分化這一特性，使其可作為理想的種子細(xì)胞用于組織工程和細(xì)胞替代治療，引起了研究者們的廣泛關(guān)注。本文就hUCMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化以及其在血管內(nèi)皮組織工程中的應(yīng)用做簡要綜述，并對這一領(lǐng)域存在的問題及可能的研究方向進(jìn)行展望。

1 hUCMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

1.1 血管生成素-1(Ang-1)的調(diào)節(jié)作用 Ang-1是由血管周圍間質(zhì)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它通過與內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，使其磷酸化，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對新生血管的形成進(jìn)行調(diào)節(jié)［7］。Ang-1在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中扮演著不可替代的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1/Tie系統(tǒng)具有抑制新生血管形成和減少血管滲漏的特點(diǎn)，同時(shí)可促進(jìn)血管的成熟。Baffert等［7］提出人血管生成素屬于分泌型細(xì)胞因子家族成員，依據(jù)其氨基酸序列差異分為 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4和Ang/Tie-2系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死部位Ang-2表達(dá)上調(diào)，而Ang-1不改變或輕微增加，使病變部位 Ang-2和Ang-1之間的平衡被破壞，其比值上調(diào)。在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中，Ang-1有著不可替代的調(diào)節(jié)作用，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)hUCMSCs的應(yīng)用研究奠定了理論基礎(chǔ)。

近年來，內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)已被嘗試用于治療領(lǐng)域。有研究人員在實(shí)驗(yàn)中將EPCs經(jīng)過體外擴(kuò)增于下肢缺血或心肌缺血的動(dòng)物模型體內(nèi)輸注，發(fā)現(xiàn)可成功地促進(jìn)新血管生成，緩解缺血狀況［8］。然而內(nèi)皮細(xì)胞受到衰老及疾病等多方面因素影響，使其臨床應(yīng)用受到極大限制，故構(gòu)建新型高效穩(wěn)定血管內(nèi)皮組織工程，并將其合理地應(yīng)用于臨床來促進(jìn)血管再生則可能成為克服這些潛在問題的手段。

Kim等［9］通過構(gòu)建腺病毒載體用目的基因轉(zhuǎn)染hUCMSCs，此法為細(xì)胞依賴的基因治療方法之一。蕭鴻等［10］通過構(gòu)建Ang-1基因真核表達(dá)載體，并采用Western blot法檢測其在hUCMSCs中的表達(dá)。他們成功地用RT-PCR克隆來了人Ang-1基因序列片段，編碼區(qū)序列，純度為1182，PCR擴(kuò)增的片段長度為115 kb，與預(yù)期片段大小相近。雙酶切鑒定重組pEGFP-N1-Ang-1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒顯示目的基因與預(yù)期基因序列的同源性為100%。這一病毒載體構(gòu)建的感染細(xì)胞，為進(jìn)一步研究Ang-1防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管滲漏提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使人們對于hUCMSCs的生長分化控制又多了一條途徑。

1.2 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的促進(jìn)作用VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)作為重要的生長因子，在病理性及生理性血管新生方面發(fā)揮著獨(dú)特作用。在血管新生過程中，VEGF和bFGF之間具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)血管新生。VEGF最早是從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化得到，后研究發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于人和動(dòng)物的腦、肺、肝、脾、腎和眼等組織。眾所周知，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成，而VEGF作為一種很強(qiáng)的促進(jìn)血管新生的因子，可在腫瘤患者體內(nèi)高效表達(dá)，當(dāng)治愈時(shí)VEGF表達(dá)水平則會迅速下降。因此，在理論上VEGF以其高表達(dá)作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，為標(biāo)記生長旺盛的腫瘤組織進(jìn)行追蹤的靶向給藥治療。Zayed等［11］通過構(gòu)建CIB1缺陷小鼠證明了VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向血管方向分化，從而使得我們從細(xì)胞水平上對缺血性疾病的血管再生有了更加深入的了解。

此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)VEGF在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，可有效刺激其向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，同時(shí)可促進(jìn)其他細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。例如長久以來糖尿病潰瘍的再生修復(fù)一直是困擾臨床醫(yī)生的一大難題，而糖尿病潰瘍不容易愈合的一個(gè)重要因素就是其潰瘍局部VEGF濃度顯著下降。這就意味著可通過向創(chuàng)傷部位添加VEGF來幫助潰瘍愈合，而且這種方法也被證明是非常有效的。Mayer等［12］研究發(fā)現(xiàn)VEGF在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)增高時(shí)可增加新生血管形成以達(dá)到加速骨折愈合的效果。VEGF對hUCMSCs促血管內(nèi)皮細(xì)胞分化作用使得其在腎臟疾病的治療領(lǐng)域也開始扮演了一個(gè)顯著的新角色，通過微血管的再生來改善腎臟的缺血壞死。此外，孫洞簫等［13］對IgA腎病模型小鼠靜脈輸注hUCMSCs，觀察hUCMSCs移植對 IgA腎病小鼠腎功能及腎組織的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植對IgA腎病小鼠腎功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)了腎組織中VEGF表達(dá)有關(guān)。這一研究結(jié)果為臨床治療腎臟創(chuàng)傷提供了一些新的思路，而且VEGF在hUCMSCs定向分化過程中的作用機(jī)制又得到進(jìn)一步的發(fā)展與證實(shí)。除VEGF外，其實(shí)還有很多細(xì)胞因子可影響間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮方向分化。Chen等［14］通過分組給予急性腎損傷大鼠注射hUCMSCs和肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)hUCMSCs，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)頸動(dòng)脈注入后，療效較單細(xì)胞治療組更顯著。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡蛋白酶、白細(xì)胞介素等均不同程度地下調(diào)。

1.3 條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的hUCMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化 細(xì)胞外的微環(huán)境對hUCMSCs的特定分化有重要意義，不同條件誘導(dǎo)可決定細(xì)胞的不同分化方向。因此，通過改變培養(yǎng)環(huán)境中氧含量或接種密度抑或向特定時(shí)期生長狀態(tài)良好的hUCMSCs培養(yǎng)基中加入一些特殊調(diào)節(jié)物質(zhì)，可很好地促進(jìn)其向脂肪、骨、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)行分化。Kafienah等［15-16］對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧等一系列條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下向軟骨細(xì)胞分化，用所得細(xì)胞對軟骨退行性疾病進(jìn)行細(xì)胞組織工程治療做了大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，并且取得了理想的結(jié)果。

這一細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人們對hUCMSCs的分化可控調(diào)節(jié)，達(dá)到人們對目的細(xì)胞的需求，進(jìn)而為臨床研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。陳恩等［17］通過將生長狀態(tài)良好的P3-P6的hUCMSCs培養(yǎng)于內(nèi)皮分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(即5%的胎牛血清、100 ng/ml血管內(nèi)皮生長因子、50 ng/ml表皮生長因子和1%抗生素的LG-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，置37℃，5%的 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，每3天換一次液。實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光技術(shù)檢測特異性內(nèi)皮蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后hUCMSCs表達(dá)3種內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白，即血管內(nèi)皮生長因子2(FLK-1/VEGF2)、von Willebrand 因子(von Willebrand factor，Vwf)和血管內(nèi)皮黏附素復(fù)合體(vascular endothelialcadherin，VE-cadherin)。他們還通過 Real-Time PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、微血管形成能力鑒定內(nèi)皮分化和低密度脂蛋白吸收能力鑒定內(nèi)皮分化等一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠促進(jìn)其向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化演進(jìn)，可為構(gòu)建內(nèi)皮組織工程提供新的種子細(xì)胞來源。

2 hUCMSCs的臨床應(yīng)用

2.1 心血管疾病方面 近年，缺血性疾病，特別是心血管疾病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)明顯上升，嚴(yán)重影響著人們的健康、制約著社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。在我國每年因冠心病需要移植血管行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)者有十多萬，因下肢靜脈疾病、血管先天性異常和創(chuàng)傷等原因需接受手術(shù)的患者更多，需大量合適的血管移植物。當(dāng)今臨床應(yīng)用的代替材料主要是來自于國外，但這些材料有弊端，如移植后容易形成栓子、免疫排斥，移植一段時(shí)間后生物學(xué)功能的喪失等。為解決這些問題，探尋新的可再生移植材料成了廣大學(xué)者的工作重心。Zhou等［18］利用大鼠進(jìn)行hUCMSCs局部移植來治療脊髓損傷引起的運(yùn)動(dòng)障礙，療效顯著。Ding等［19］將 hUCMSCs移植到大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠的腦皮質(zhì)內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受hUCMSCs移植的大鼠軀體不對稱性顯著減輕，自主活動(dòng)明顯減少，而自發(fā)活動(dòng)顯著增加;梗死區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)生理活性顯著增加;缺血半暗帶內(nèi)表達(dá)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、微管相關(guān)蛋白-2和神經(jīng)元核抗原的細(xì)胞比例分別為9%、6%和6%;缺血區(qū)的巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和β1-整合素的表達(dá)水平顯著增加;缺血區(qū)微血管灌注、半暗帶內(nèi)神經(jīng)血管密度以及缺血區(qū)皮質(zhì)腦血流均顯著增加，且趨化因子-1、膠質(zhì)酸GDNF和BDNF的表達(dá)水平為對照組的2．0～3．5倍，使缺血病變得到緩解。在心肌梗死的治療中，hUCMSCs作為一種原始干細(xì)胞，本身就具有很強(qiáng)的增殖能力，同時(shí)免疫原性也達(dá)到了最低限度。在心血管支架的構(gòu)建中，這種細(xì)胞具有很高的生物活性，可允許其他細(xì)胞黏附、生長和機(jī)化，完全與移植后的機(jī)體吻合，發(fā)揮生物學(xué)活性。

近年來，研究者通過向?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ腿毖獕乃啦课换蜢o脈注射hUCMSCs，發(fā)現(xiàn)壞死部位出現(xiàn)血管再生修復(fù)，這一發(fā)現(xiàn)引起了人們的極大興趣。杜磊［20］建立大鼠腦缺血壞死模型，然后于壞死部位注射hUCMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植組大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)較對照組有明顯改善。免疫熒光染色證明，移植28 d后不但有一定數(shù)量hUCMSCs在宿主腦內(nèi)成活，并且其中大部分細(xì)胞表達(dá)NSE、MAP2、GFAP、CD31和vWF等，同時(shí)也促進(jìn)了大鼠腦神經(jīng)的恢復(fù)。Koh 等［21］和 Cao等［22］也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)hUCMSCs治療大鼠缺血性疾病效果顯著。Liao等［23］向腦卒中模型的裸鼠皮下注射MSCs混合物，飼養(yǎng)21 d后觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)大量粗細(xì)不等的血管，行切片HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中含有大量血管結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)有血液;而空白對照組中基本觀察不到血管結(jié)構(gòu)。王娟等［24］通過經(jīng)外周靜脈輸注hUCMSCs治療長期肝硬化也取得了相當(dāng)可觀的效果。與此同時(shí)hUCMSCs的低免疫原性優(yōu)點(diǎn)使得其近年來取代了病毒介導(dǎo)的基因治療，成為治療急性腎損傷的又一方法。

2.2 燒傷方面 火災(zāi)及交通事故等經(jīng)常會發(fā)生嚴(yán)重的體表燒傷。雖然部分損傷可通過美容整形修復(fù)，可是其昂貴的費(fèi)用以及巨大的傷害，讓患者難以接受。無論是自體還是異體皮膚移植，手術(shù)成功的關(guān)鍵均是移植皮膚血管網(wǎng)的建立。研究表明，皮膚移植后營養(yǎng)來源按發(fā)生先后可分為3個(gè)階段，即早期、中期和晚期［25］。對臨床皮膚移植手術(shù)成功患者進(jìn)行深入研究均可發(fā)現(xiàn)，移植后從中期開始皮片中即有血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)與創(chuàng)面基底殘存血管進(jìn)行斷端吻合，后期便開始有新生血管形成，為移植皮膚提供營養(yǎng)。組織工程皮膚、組織工程化復(fù)合皮膚和脫細(xì)胞真皮支架等均給需植皮的患者帶來極大希望，然而這些研究結(jié)果因不具備血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)、組織工程皮膚血管化受阻而停止。

胡克蘇［26］采用分離純化的hUCMSCs治療深度燒傷大鼠，發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可加快深度燒傷愈合同時(shí)還能抑制局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)血管形成和成纖維細(xì)胞增殖，參與損傷修復(fù)。表皮干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞種子在燒傷中的作用十分重要。當(dāng)注入干細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞就會分泌一些細(xì)胞因子，并在這些趨化因子的作用下向受損部位游走，進(jìn)而形成一些微血管對皮膚進(jìn)行修復(fù)。不少研究表明，MSCs參與了創(chuàng)面愈合過程，并已經(jīng)證實(shí)MSCs在創(chuàng)面微環(huán)境的作用下，通過表型發(fā)生變化形成表皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等和正常修復(fù)細(xì)胞共同參與燒傷創(chuàng)面的修復(fù)。這些研究結(jié)果不僅解決了移植物尋求方面的困擾，而且其本身向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的特性也使得組織工程皮膚中的皮膚血管分化問題迎刃而解。

2.3 糖尿病并發(fā)癥方面 隨著人們生活水平提高，糖尿病逐漸成為當(dāng)今社會威脅人們健康的代謝性疾病之一，其并發(fā)癥如糖尿病足壞疽、糖尿病視網(wǎng)膜病變等給患者帶來極大的痛苦。對糖尿病及其并發(fā)癥治療的探索成了科研和臨床需解決的重大問題。

hUCMSCs的研究與應(yīng)用為糖尿病治療開辟了新的途徑。近年有學(xué)者將出把骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或hUCMSCs植入胰腺這一特定環(huán)境中，干細(xì)胞會朝著胰島素分泌細(xì)胞定向分化，從而降低血糖［27］。干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞，誘導(dǎo)出的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。近年有學(xué)者建立了通過靜脈注射hUCMSCs治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一方法可以使病變得到一定程度的改善。劉弘光等［28］采用貼壁生長的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與大鼠胰腺細(xì)胞共同培養(yǎng)使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將這些胰島樣細(xì)胞于尾靜脈移植給STE誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，能明顯緩解糖尿病病情。樊明世［29］通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可使兔的糖尿病足部病變改善，皮溫增高，側(cè)支循環(huán)建立增多，毛細(xì)血管數(shù)量增加。這些研究都為糖尿病并發(fā)癥的治療與控制提供了一種有效安全的方法，使壞疽截肢率大大降低，從而改善患者的生活質(zhì)量［30］。通過大量學(xué)者的研究與實(shí)驗(yàn)，我們不難發(fā)現(xiàn)在不久的將來干細(xì)胞治療將可能成為糖尿病及其并發(fā)癥治療領(lǐng)域的重要方法。

3 展望

在間充質(zhì)細(xì)胞的研究與治療領(lǐng)域，hUCMSCs因簡單易得、低免疫原性及多方面可分化性等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為干細(xì)胞研究的重點(diǎn)。hUCMSCs含量豐富，較為原始，分化能力強(qiáng)，可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴(kuò)增仍能保持旺盛功能，可為實(shí)驗(yàn)和臨床提供充足的細(xì)胞來源，可利用其克隆得到穩(wěn)定的細(xì)胞系作為組織細(xì)胞工程的種子。近年越來越多的學(xué)者致力于這方面的研究，利用不同誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)因子來獲得大量脂肪、神經(jīng)、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，為臨床工作提供來源穩(wěn)定的組織工程細(xì)胞，特別是其向血管內(nèi)皮干細(xì)胞分化這方面，為臨床上困擾患者和醫(yī)師的許多難題帶來了解決的可能。

然而，目前的研究工作中也面臨著諸多難題。首先，雖然hUCMSCs是一種原始祖細(xì)胞，但是也存在著細(xì)胞的衰老與凋亡?，F(xiàn)階段重要的任務(wù)之一就是盡可能地添加一些抗衰老因子及抗氧化劑等，使hUCMSCs發(fā)揮最大的分化潛能;與此同時(shí)應(yīng)研究hUCMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵性調(diào)控因子，在更高一層的領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)對這一分化過程的靶向基因調(diào)控，并且逐步實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用，為人類健康與社會發(fā)展提供更好的保障。

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