急性冠脈綜合征生化標(biāo)記物研究中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

董剩勇 綜述 曾 強 審校

解放軍總醫(yī)院 國際醫(yī)學(xué)中心，北京 100853

傳統(tǒng)的心血管危險因素，如吸煙、血脂異常、高血壓、糖尿病等，并不能準(zhǔn)確預(yù)測心血管惡性事件。近些年來，生化標(biāo)記物的研究成為急性心肌缺血診斷和預(yù)后評估研究中的熱點[1]。新的生化標(biāo)記物不斷涌現(xiàn)，如心肌肌鈣蛋白T或I(cTnT或cTnI)、C-反應(yīng)蛋白、氨基末端腦鈉肽原(N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、非結(jié)合游離脂肪酸、缺血修飾白蛋白、髓過氧化酶、妊娠相關(guān)血漿蛋白A、可溶性CD40配體、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2和生長分化因子15等，并逐步用于急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的早期診斷和預(yù)后評估[1]。不斷改善的檢測手段也極大地提高了現(xiàn)有標(biāo)記物的診斷靈敏度和特異度以及標(biāo)記物預(yù)測心血管惡性事件的能力[2]。然而，由于ACS動脈粥樣硬化斑塊的異質(zhì)性和復(fù)雜性，現(xiàn)有生化標(biāo)記物(包括cTnT和cTnI在內(nèi))并不能全面地反映ACS疾病進(jìn)展及預(yù)后狀態(tài)[3]。因此，從海量的蛋白質(zhì)組中尋找新的、能補充反映心肌損傷程度或發(fā)病時間的、在診斷和危險分層上有高敏感度和特異度的生化標(biāo)記物仍然是非常有必要的[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展正好滿足了這一需求。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正逐步由傳統(tǒng)的二維電泳(2-dimensional electrophoresis，2DE)技術(shù)向高通量和高靈敏度的質(zhì)譜分析(mass spectrometry，MS)技術(shù)過渡。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤生化標(biāo)記物的檢測[5]，其在ACS生化標(biāo)記物研究中的應(yīng)用報道較少[3-6]。本文將從血液蛋白質(zhì)組學(xué)、動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學(xué)以及心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)3個方面就蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在ACS生化標(biāo)記物研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 血液蛋白質(zhì)組學(xué)

1.1 血漿 血漿中大約有900 000種蛋白。從臨床角度來看，ACS患者血漿標(biāo)本的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測最有可能提供診斷和預(yù)后評估信息。目前觀念認(rèn)為，利用MS技術(shù)檢測胸痛患者的血漿標(biāo)本可得到質(zhì)譜峰值群(蛋白譜)，通過對不同蛋白譜的直接比較可以快速地篩選出ACS患者，從而節(jié)省了蛋白峰值鑒定所需要的時間而實現(xiàn)ACS的早期診斷。并且，這種蛋白譜包括了多種蛋白質(zhì)，往往比現(xiàn)有的單一生化標(biāo)記物有著更出色的診斷和預(yù)后評估敏感性[7]。我們課題組既往運用表面增強激光解吸附-時間飛行(surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight，SELDITOF)質(zhì)譜技術(shù)對500名ACS患者的血漿樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，得到1 921.09、2 124.2和20 887.3質(zhì)核比(m/z)的蛋白峰值群，其在ACS患者早期危險分層上的曲線下面積(AUC=0.93，P＜0.001)明顯高于傳統(tǒng)的生化標(biāo)記物NT-proBNP(AUC=0.63，P＜0.001)和cTnT(AUC=0.74，P＜0.001)[8]。我們課題組隨后發(fā)現(xiàn)利用SELDI-TOF MS技術(shù)得到的新標(biāo)記物4 174.39 m/z預(yù)測ACS患者長期主要不良心血管事件的能力(AUC=0.73，P＜0.001)也 優(yōu) 于cTnT(AUC=0.45，P=306)和肌酸激酶同工酶-MB(AUC=0.51，P=870)[9]。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測ACS患者血漿，發(fā)現(xiàn)新的生化標(biāo)記物用以闡述ACS不同致病機制或指導(dǎo)ACS治療[10]。例如，Kopetz等[11]采用2DE和液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術(shù)對9名存在冠脈慢流現(xiàn)象的ACS患者血漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在胸痛發(fā)作時抗氧化酶對氧磷脂酶-1、抗胰凝乳蛋白酶α-1和抗胰蛋白酶α-1表達(dá)水平明顯增加，從而認(rèn)為炎癥/氧化壓力是這部分患者再發(fā)ACS的重要致病機制。Distelmaier等[12]首次利用質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(MS/MS)對急性心肌梗死(alternate mark inversion，AMI)患者斑塊破裂處的血漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并與股動脈鞘處的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)斑塊破裂處血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)高表達(dá)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)低表達(dá)，從而認(rèn)為當(dāng)中性粒細(xì)胞釋放MMP-9增多時，后者降解了從血漿彌散到斑塊細(xì)胞外基質(zhì)中的PEDF，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力減弱，斑塊內(nèi)組織氧化壓力增強，最終導(dǎo)致斑塊破裂。Eberini等[13]利 用2DE和LC-MS/MS技 術(shù) 檢 測AMI患者血漿，發(fā)現(xiàn)AMI患者溶栓治療后載脂蛋白A-1存在著顯著的降解，引起血液高密度脂蛋白的運載能力降低，進(jìn)而血管保護(hù)能力降低，最終導(dǎo)致溶栓后再行冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)者預(yù)后更差。

還有學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測ACS患者血漿中現(xiàn)有生化標(biāo)記物的不同亞型或修飾形式，為生化標(biāo)記物抗體效能的評估或ACS不同疾病狀態(tài)的特異性診斷提供更多的信息。Bates等[14]和Guy等[15]利用多種cTnT單克隆抗體和cTnI單克隆抗體結(jié)合MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)cTn在AMI患者中存在著游離、復(fù)合體、水解片段、共價交聯(lián)以及磷酸化等多種修飾形式。這些修飾形式的存在不僅影響著不同抗體的檢測效能，也可能反映了AMI患者的心肌損傷程度以及不同預(yù)后情況[16]。Fujimoto等[17]利用磁珠抗體結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-時間飛行(matrix-assisted laser desorption/ionization TOF，MALDI-TOF)質(zhì)譜技術(shù)對105例接受PCI手術(shù)的缺血性心臟病患者血漿樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)含有32個氨基酸的腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)在血漿中存在著BNP(3-32)、BNP(4-32)和BNP(5-32)三種片段形式和BNP(1-32)的完整形式，在隨訪6個月后冠脈再狹窄的患者血漿中BNP(5-32)/BNP(3-32)的比例明顯低于冠脈未狹窄的患者，而利用常規(guī)ELASA法檢測到的血漿BNP水平在再狹窄患者和未狹窄患者之間沒有差異；當(dāng)BNP(5-32)/BNP(3-32)比值達(dá)到1.52時，排除缺血性心臟病患者冠脈再狹窄的靈敏度為100%?？梢?，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測ACS血漿中現(xiàn)有生化標(biāo)記物的不同修飾形式比單純的ELASA方法更準(zhǔn)確、更有意義。

1.2 血液循環(huán)單核細(xì)胞 單核細(xì)胞在動脈粥樣硬化形成過程中具有重要作用。有研究報道，對ACS患者血液中的單核細(xì)胞采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，以期獲得新的ACS生化標(biāo)記物[18]。Barderas等[19]利用2DE/MS方法檢測非ST段抬高性ACS(non-ST-segment elevation ACS，NSTEACS)患者血液中的循環(huán)單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)17種蛋白與穩(wěn)定性心絞痛患者相比存在著差異； 并且，隨著NSTEACS患者病情的好轉(zhuǎn)，存在差異的蛋白數(shù)量逐漸減少，提示單核細(xì)胞中這17種蛋白可能與NSTEACS的發(fā)病密切相關(guān)。在這17種蛋白中，NSTEACS發(fā)作時抗動脈粥樣硬化蛋白對氧磷酶1和熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70以及抗炎癥蛋白蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶低表達(dá)，而致動脈粥樣硬化的組織蛋白酶D和促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞的烯醇化酶1高表達(dá)，也提示了這些蛋白具有成為潛在的ACS新生化標(biāo)記物的可能[19-20]。

1.3 血小板 血小板活化在ACS病理進(jìn)展中扮演著基礎(chǔ)的角色。因為血小板沒有細(xì)胞核，所以非常適合于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Parguina等[21-22]首次利用2DE/MALDI-TOF MS技術(shù)分別于2010年和2011年對NSTEACS患者和ST段抬高性心肌梗死(ST-segment elevation MI，STEMI)患者血液中血小板進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定型缺血性心肌病患者相比，NSTEACS和STEMI患者血小板中分別有40個和56個蛋白位點存在著差異，其中數(shù)個蛋白涉及到整合素和糖蛋白Ⅵ信號傳導(dǎo)通路，并且隨著ACS發(fā)病后時間的延長，存在差異的蛋白數(shù)量逐漸減少，提示這些信號通路可能與ACS患者血小板活化密切相關(guān)。隨后，Ló pez-Farr é等[23]也利用2DE/MALDI-TOF MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)ACS患者血小板中細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、糖酵解途徑蛋白和細(xì)胞相關(guān)抗氧化系統(tǒng)表達(dá)降低。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測這些差異蛋白可為血小板相關(guān)的ACS生化標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)提供新的途徑[24]。

1.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞在維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和完整性上起到了重要作用，且外周血液中循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與心血管惡性事件呈負(fù)相關(guān)[25]。Pula等[26]利用MALDI-TOF MS結(jié)合LC方法對循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞通過旁分泌胸苷磷酸化酶而起到促血管生成作用。Mourino-Alvarez等[27]進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測ACS患者血液中循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞高水平表達(dá)DNA修復(fù)和mRNA剪接相關(guān)蛋白，并且ACS患者內(nèi)皮祖細(xì)胞中血液凝固相關(guān)蛋白和5HT4型、5HT3型等受體介導(dǎo)的信號通路與健康對照組相比存在差異。這些研究不僅進(jìn)一步揭示了內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物特征，也提示了利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞源性ACS生化標(biāo)記物的潛在價值。

2 動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學(xué)

目前ACS血液蛋白質(zhì)組學(xué)的難處在于從粥樣斑塊釋放至血液中的蛋白質(zhì)含量非常少，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)難以完全將這些血液中低含量的蛋白質(zhì)從高含量的蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)中檢測出來[3]。此外，血液中循環(huán)細(xì)胞的分離和蛋白的提取是一個費時的過程，其中內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離還缺乏流式細(xì)胞技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)的支持[27]?；谝陨显颍袑W(xué)者轉(zhuǎn)而利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測動脈粥樣斑塊組織或組織分泌蛋白，并認(rèn)為在斑塊組織中檢測出來的新蛋白很有可能會分泌至血液中，進(jìn)而被常規(guī)方法檢測而成為潛在的ACS生化標(biāo)記物[6]。

2.1 全組織 Bagnato等[28]首次報道了利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)直接檢測動脈粥樣斑塊全組織。該學(xué)者首先應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)獲取人冠脈斑塊組織后，再利用LC-MS/MS技術(shù)直接對斑塊組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了806個冠脈粥樣硬化相關(guān)蛋白，其中PEDF、骨膜蛋白和膜鏈蛋白1被免疫組化方法所證實，并有可能成為ACS診斷的新生化標(biāo)記物。隨后，De Kleijn等[29]利用LC-MS技術(shù)分析動脈粥樣斑塊組織，發(fā)現(xiàn)了一個潛在的生化標(biāo)記物—骨橋素，其與3年心血管事件密切相關(guān)。Lepedda等[30]也利用2DE/MALDI-TOF MS技術(shù)分析了不穩(wěn)定粥樣斑塊組織和穩(wěn)定粥樣斑塊組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)前者HSP27和膜聯(lián)蛋白A10水平低于后者，而纖維蛋白原片段D水平則高于后者，研究認(rèn)為這些差異蛋白與ACS心肌缺血事件中的斑塊穩(wěn)定性有關(guān)。以上研究也進(jìn)一步提示對粥樣斑塊組織直接進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的方法有助于發(fā)現(xiàn)更多有ACS診斷和預(yù)后評估價值的新生化標(biāo)記物。

2.2 內(nèi)膜組織 考慮到脂質(zhì)核、纖維帽等動脈粥樣斑塊組織不同層的異質(zhì)性會導(dǎo)致全組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果復(fù)雜，有研究轉(zhuǎn)而分析特異性更高的粥樣硬化冠脈內(nèi)膜層[31]。因為動脈粥樣硬化病變起始于內(nèi)膜層，所以內(nèi)膜層的蛋白質(zhì)組學(xué)分析將有可能為那些無先驅(qū)癥狀的ACS患者提供新的早期診斷生化標(biāo)記物。De la Cuesta等[31]從接受冠脈旁路移植術(shù)或心臟移植術(shù)的患者中獲取粥樣硬化冠脈、粥樣硬化旁冠脈以及橈動脈組織，然后利用激光顯微切割技術(shù)分離出內(nèi)膜組織后再利用2DE和MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與粥樣硬化旁冠脈和橈動脈內(nèi)膜相比，粥樣硬化冠脈內(nèi)膜有13個蛋白存在著差異，其中膜聯(lián)蛋白4、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2和鐵蛋白輕鏈為新發(fā)現(xiàn)的粥樣硬化冠脈內(nèi)膜蛋白質(zhì)，其也有可能成為新的潛在ACS斑塊組織早期生化標(biāo)記物。

2.3 組織分泌蛋白 由于動脈粥樣硬化組織包含了許多結(jié)構(gòu)蛋白，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)直接分析粥樣斑塊全組織或內(nèi)膜組織時這些結(jié)構(gòu)蛋白可能會掩蓋某些選擇性表達(dá)、低水平的潛在生化標(biāo)記物。動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究的另一策略就是對動脈粥樣斑塊組織進(jìn)行培養(yǎng)，然后利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析組織分泌蛋白，從而可避免結(jié)構(gòu)蛋白的干擾[3,32]。Martin-Ventura等[33]利用2DE和MALDI-TOF MS技術(shù)以及LC-MS/MS技術(shù)對動脈粥樣斑塊組織培養(yǎng)液和正常動脈組織培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣斑塊組織培養(yǎng)液中HSP27表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者血漿中HSP27水平也明顯低于健康對照組。該報道認(rèn)為，HSP27與平滑肌細(xì)胞的移動和斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，其很有希望成為預(yù)測動脈粥樣硬化及ACS斑塊惡化的潛在生化標(biāo)記物。Blanco-Colio等[34]利用SELDITOF MS技術(shù)對動脈粥樣斑塊組織培養(yǎng)液中的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)可溶性腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子(sTweak)低表達(dá)，隨后也進(jìn)一步在動脈粥樣硬化患者血漿中檢測到低表達(dá)的sTweak，提示sTweak可能為ACS潛在的生化標(biāo)記物。Cooksley-Decasper等[35]利用類似的斑塊組織培養(yǎng)方法和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析動脈粥樣斑塊組織分泌蛋白，發(fā)現(xiàn)結(jié)合斑珠蛋白也可能為ACS潛在的生化標(biāo)記物。

3 心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)

ACS最主要的病理過程是引起心肌缺血、損傷甚至壞死。針對心肌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測能夠得到心肌損傷不同程度、不同部位、不同時間下的蛋白譜差異，從而為ACS的特異性診斷、差異化治療以及預(yù)后評估提供臨床指導(dǎo)策略[36]。然而，不管在臨床實踐還是在基礎(chǔ)實驗中，獲取人心肌組織的難度極大，以至于目前關(guān)于心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報道極少。Chen等[37]利用2DE和LC-MS/MS技術(shù)檢測鼠缺血心肌蛋白，發(fā)現(xiàn)線粒體乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)有4種磷酸化的形式，磷酸化的ALDH2為激活態(tài)，能保護(hù)心肌和減少心肌的缺血損傷；當(dāng)對ACS患者給予長期的硝酸甘油治療時，ALDH2將去磷酸化并失活，從而增加心肌缺血性損傷；而在約40%的東亞人群中，ALDH2處于非激活突變狀態(tài)(487位的谷氨酸被賴氨酸代替)，此時對存在ALDH2突變的ACS患者給予持續(xù)的硝酸甘油將加劇心肌缺血，如果利用藥物增加ALDH2的活性將可能為這類患者帶來好處，提示ALDH2具有潛在的可能成為指導(dǎo)ACS治療策略的生化標(biāo)記物。Barallobre-Barreiro等[38]構(gòu)建豬心肌缺血/再灌注損傷模型后，利用LC-MS/MS技術(shù)首次對心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)盡管損傷的左心室心肌與相鄰部位的心肌ECM基因表達(dá)相似，但損傷的心肌ECM中促進(jìn)心肌重構(gòu)的蛋白(如軟骨間質(zhì)蛋白1、軟骨基質(zhì)蛋白4、細(xì)胞外脂肪細(xì)胞增加劑結(jié)合蛋白1等)表達(dá)水平明顯增高，這些新的心肌ECM蛋白隨后在人左心室心肌組織中得到證實；并且，蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在心肌缺血后心肌重構(gòu)的早期和晚期階段，轉(zhuǎn)化生長因子β1均位于ECM重構(gòu)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心，研究提示心肌缺血/再灌注損傷后早期檢測ECM重構(gòu)、了解早期和晚期心肌組織纖維化特征，可為ACS的個性化治療提供依據(jù)； 同時也提示通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測ECM蛋白可得到具有臨床意義的ACS預(yù)后評估生化標(biāo)記物和藥物治療靶點。

4 展望

由于ACS是多因素導(dǎo)致的有復(fù)雜病理生理過程的急性、高危性疾病，不太可能有單一的生化標(biāo)記物能夠高特異性和高靈敏度地診斷ACS。從血液、動脈粥樣硬化組織以及心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)所獲得的新生化標(biāo)記物有希望利用多標(biāo)記物方法幫助闡述ACS致病的分子機制，改變目前ACS的臨床診斷方式，發(fā)現(xiàn)新的能作為干涉治療靶點并使ACS的治療和預(yù)后評估更為接近個體化[3]。最后，從標(biāo)本來源和臨床實踐來看，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)可能是ACS生化標(biāo)記物研究中最合適、最快速的途徑，也是最有可能將蛋白質(zhì)組學(xué)成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的途徑。總之，高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐步用于ACS生化標(biāo)記物的研究，其直接應(yīng)用于臨床仍然是很有希望的。今后ACS生化標(biāo)記物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)重點關(guān)注ACS粥樣斑塊形成和斑塊破裂的分子機制，以及蛋白質(zhì)及其功能相關(guān)的修飾在細(xì)胞通路中的研究，以便產(chǎn)生新的假設(shè)以促進(jìn)臨床上ACS新的診斷、治療和(或)預(yù)后評估生化標(biāo)記物。

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