噬菌體療法在耐藥性細(xì)菌感染中應(yīng)用的研究進(jìn)展

李菁華，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長春 130021）

細(xì)菌的耐藥性已經(jīng)成為全球醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)，特別是“超級(jí)細(xì)菌”的頻頻出現(xiàn)，使人類重新步入“前抗生素”時(shí)代的可能性正成為現(xiàn)實(shí)。2010年8月英國和印度學(xué)者［1］發(fā)現(xiàn)一種攜帶NDM－1耐藥基因的新型“超級(jí)細(xì)菌”，這種細(xì)菌能夠?qū)Π◤V譜抗生素碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎所有抗生素產(chǎn)生耐藥性。2010年10月中國疾病預(yù)防控制中心和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院［2］同時(shí)宣布在中國內(nèi)地的寧夏和福建均發(fā)現(xiàn)了這種“超級(jí)細(xì)菌”。2010年中國CHINET細(xì)菌耐藥性檢測網(wǎng)對(duì)國內(nèi)不同地區(qū)14所教學(xué)醫(yī)院臨床分離菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)［3］的結(jié)果顯示：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin－resistant staphylococcus aureus，MRSA）的檢出率為51.7%，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌的檢出率為71.6%，大腸埃希菌、肺炎克雷白菌和變形桿菌產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLS）的檢出率分別為 56.2%、43.6%和5.5%。耐藥菌株的日益增多，抗生素已無法達(dá)到理想的治療效果，而噬菌體作為一種傳統(tǒng)的抗菌療法又重新受到關(guān)注。近些年來，歐美國家的一些學(xué)者陸續(xù)發(fā)表了有關(guān)噬菌體抗菌技術(shù)的專稿，就噬菌體的基礎(chǔ)性研究和開發(fā)予以積極評(píng)價(jià)，認(rèn)為噬菌體的天然靶向作用、抗菌的專一性和高效性及其相關(guān)研究為傳染病控制開創(chuàng)了新的領(lǐng)域，特別是針對(duì)耐藥性細(xì)菌的噬菌體療法具有重要的臨床意義。

1 噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，最早由英國細(xì)菌學(xué)家Twort［4］及法籍－加拿大微生物學(xué)家d’Herelle［5］分 別 于1915和1917年發(fā)現(xiàn)。Brussow等［6］研究顯示：自然界中約有1032個(gè)噬菌體存在，這個(gè)數(shù)目是細(xì)菌數(shù)量的十余倍。噬菌體在其生活周期過程中呈現(xiàn)2種類型，即毒性噬菌體和溫和噬菌體。毒性噬菌體能使宿主菌細(xì)胞迅速地裂解死亡，而溫和噬菌體在感染宿主菌后一般不引起宿主菌立即死亡，而是將自身的基因組整合至宿主菌的染色質(zhì)中，這種狀態(tài)又叫做溶原狀態(tài)。因此，用于治療和控制細(xì)菌性感染的噬菌體主要是指毒性噬菌體。噬菌體在侵襲細(xì)菌的過程中表現(xiàn)出很獨(dú)特的專一性，這主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：一是噬菌體主要侵襲細(xì)菌，而對(duì)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞無任何影響；二是每種噬菌體只能侵襲某種特定的細(xì)菌，例如，能侵襲大腸埃希菌的噬菌體對(duì)其他細(xì)菌如葡萄球菌、變形桿菌等則無任何作用。此外，噬菌體裂解細(xì)菌的效率非常高，噬菌體感染細(xì)菌后，通過異常特殊機(jī)制，噬菌體DNA進(jìn)入菌細(xì)胞，隨后進(jìn)行生物合成，產(chǎn)生大量子代噬菌體，子代噬菌體從細(xì)胞內(nèi)釋放至細(xì)胞外，宿主細(xì)胞隨即死亡。超過100個(gè)子代噬菌體從每個(gè)菌細(xì)胞中釋放出來，而每個(gè)噬菌體又可以感染新的菌細(xì)胞，因此噬菌體裂解細(xì)菌的效能非常驚人。

2 噬菌體療法的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用

2.1 噬菌體用于動(dòng)物細(xì)菌感染的初步研究 d’Herelle［5］最初開展噬菌體療法是在動(dòng)物性疾病模型中進(jìn)行，其首先將噬菌體用于禽類傷寒的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接受噬菌體治療的動(dòng)物對(duì)雞沙門菌（Salmonella gallinarum）的感染有很好的保護(hù)作用。此外，d’Herelle又采用噬菌體治療由出血敗血癥性巴斯德菌（Pasteurella multocida）所致牛出血性敗血癥，同樣取得良好的效果。由于在動(dòng)物的消化道感染和敗血癥治療中取得進(jìn)展，d’Herelle決定將這一方法應(yīng)用于人類疾病，其從痢疾患者的排泄物中分離并純化痢疾桿菌噬菌體，為了確保安全性，其與助手首先口服這種噬菌體制劑，然后用于治療痢疾患者。20世紀(jì)20年代利用噬菌體治愈鼠疫患者［8］在歐洲引起轟動(dòng)，d’Herelle在埃及發(fā)現(xiàn)4名鼠疫患者，將噬菌體注射至患者的腹股溝淋巴結(jié)后4名鼠疫患者奇跡般地恢復(fù)。此后的十幾年中，由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件的限制以及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的問題，噬菌體療法進(jìn)展緩慢。二戰(zhàn)結(jié)束后抗生素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用，基本解決了細(xì)菌性感染的問題。因此，西歐和美國學(xué)者［9］幾乎完全放棄了噬菌體的研究。但是，前蘇聯(lián)和東歐一些國家的科學(xué)家未受到西歐和美國科學(xué)界對(duì)噬菌體療法放棄的影響，仍然對(duì)噬菌體的抗感染作用進(jìn)行深入的研究。波蘭的Hieszfeld研究所和前蘇聯(lián)格魯吉亞共和國的Eliava研究院進(jìn)行了一項(xiàng)研究［10］，于1981—1986年組織十幾個(gè)科學(xué)部門，對(duì)噬菌體療法的效果進(jìn)行系統(tǒng)的臨床觀察，患者包括1周齡的嬰兒到86歲的老年人，主要針對(duì)抗生素治療失敗的患者，疾病的種類包括持久不愈的膿漏、細(xì)菌性敗血癥、膿腫、呼吸道化膿性感染、支氣管肺炎、尿道感染和化膿性腹膜炎，或用于術(shù)后和外傷感染的預(yù)防及治療。治療評(píng)價(jià)指標(biāo)包括癥狀的改善、局部傷口愈合和致病菌的消除等，其成功率為75%～100%（平均治療成功率為92%）。

20世紀(jì)80年代英國學(xué)者Smith等［11］開始進(jìn)行一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以證實(shí)噬菌體治療的效果和安全性，其以噬菌體治療具有莢膜多糖抗原細(xì)菌引起感染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：噬菌體的治療效果明顯高于四環(huán)素、鏈霉素、青霉素和磺胺類藥物，且利用噬菌體治療小牛腹瀉取得了較好的保護(hù)效果。Soothill等［12］以豚鼠為模型研究噬菌體對(duì)燒傷后銅綠假單胞菌感染的治療效果，并證實(shí)如在燒傷植皮前用噬菌體進(jìn)行預(yù)處理，可預(yù)防移植排斥反應(yīng)。Cerveny等［13］通過皮下注射弧菌建立小鼠全身感染和局部感染的動(dòng)物模，結(jié)果顯示：靜脈注射噬菌體治療能明顯提高小鼠的存活率，且能減輕小鼠全身和局部感染。Chibani－Chennoufi的研究小組［14］從環(huán)境和幼兒腹瀉患者中分離出4株具有寬泛感染能力的大腸埃希菌噬菌體，進(jìn)一步的研究顯示：這些噬菌體對(duì)腹瀉相關(guān)大腸埃希菌的不同血清型具有明顯的裂解作用。將這些噬菌體放入動(dòng)物的飲用水中，從動(dòng)物的排泄物中能分離出具有同樣生物學(xué)特性的噬菌體，同時(shí)動(dòng)物體內(nèi)耐氨芐青霉素大腸埃希菌已被裂解，并且動(dòng)物的腸黏膜無任何病理學(xué)改變。因此推測：動(dòng)物使用噬菌體后，噬菌體可在動(dòng)物群中擴(kuò)散，這對(duì)進(jìn)一步的群體細(xì)菌感染可起到預(yù)防作用。

2.2 噬菌體用于革蘭陽性耐藥菌感染的研究 MRSA自上世紀(jì)60年代就已被發(fā)現(xiàn)［15］，而目前在醫(yī)院內(nèi)分離的金黃色葡萄球菌絕大多數(shù)均是MRSA［16］，MRSA是“超級(jí)細(xì)菌”成員之一，可引起各種類型的化膿性感染，只有萬古霉素能控制感染。利用噬菌體治療由MRSA所致動(dòng)物感染已有相關(guān)的報(bào)道。O’Flashery等［17］利用金黃色葡萄球菌噬菌體K對(duì)從醫(yī)院分離的36株MRSA和2株耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分析，其中噬菌體K能裂解20株MRSA和2株耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌。Matsuzaki等［18］在MRSA引起的小鼠感染實(shí)驗(yàn)中，將8×108CFU·mL－1MRSA注射至小鼠體內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行噬菌體ΦMR11（感染復(fù)數(shù)為50）治療，結(jié)果顯示：未經(jīng)噬菌體治療的小鼠7d死亡率大于90%。細(xì)菌生物膜的形成對(duì)抗生素的療效也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。Sass等［19］利用分子克隆技術(shù)獲得噬菌體Φ11編碼的裂解酶（endolysin），如果將該裂解酶加入到處于對(duì)數(shù)生長期的具有生物膜的金黃色葡萄球菌（NCTC8325）和表皮葡萄球菌（O－47）培養(yǎng)液中，細(xì)菌的數(shù)量在20min內(nèi)下降60%。耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin－resistant enterococci，VRE）是“超級(jí)細(xì)菌”的另一重要成員，于1989年在美國、法國和英國首次被發(fā)現(xiàn)，美國醫(yī)院內(nèi)感染監(jiān)測系統(tǒng)報(bào)告［20］顯示：20%的腸球菌分離株均呈現(xiàn)對(duì)萬古霉素的耐藥性。VRE感染對(duì)艾滋?。ˋIDS）患者、癌癥患者、器官移植和老年患者極易造成死亡。因此，積極預(yù)防VRE感染是當(dāng)前全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題［21］。位于美國馬里蘭州的Exponential Biotherapies公司利用噬菌體治療由VRE引起的動(dòng)物菌血癥的研究［22］顯示：以致死量的 VRE（109CFU·mL－1）腔內(nèi)注射，48h后動(dòng)物全部死亡。如果在感染后的45min，僅給予一次性噬菌體治療（3×108PFU·mL－1），動(dòng)物的存活率為100%。如果在感染后24h給予噬菌體治療，動(dòng)物的存活率約為50%。

2.3 噬菌體用于革蘭陰性耐藥菌感染的研究 革蘭陰性桿菌是構(gòu)成醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原體，包括腸桿菌科的大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌。臨床常見的產(chǎn)超廣譜酶大腸埃希菌、多重耐藥的銅綠假單胞菌、泛耐藥肺炎克雷伯桿菌和近年發(fā)現(xiàn)攜帶NDM－1耐藥基因的革蘭陰性桿菌均屬于“超級(jí)細(xì)菌”［23］?！俺?jí)細(xì)菌”的存在及其家族新成員的不斷出現(xiàn)已引起國際社會(huì)的高度關(guān)注。面對(duì)當(dāng)前細(xì)菌耐藥性的緊迫性，相關(guān)權(quán)威學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)正積極應(yīng)對(duì)，包括積極尋找新的靶向藥物和新的抗菌療法。Wang等［24］采用耐亞胺培南銅綠假單胞菌感染動(dòng)物的研究顯示：以細(xì)菌的最小致死量（3×107CFU·mL－1）注射小鼠腹腔后，動(dòng)物在24h內(nèi)全部死亡，如果在感染后15和30min通過腹腔注射噬菌體（感染復(fù)數(shù)＞0.1時(shí)），動(dòng)物的存活率均為100%，在感染后180和360min給予噬菌體治療，存活率則降至50%和20%，說明早期應(yīng)用噬菌體的療效非常明顯。另一項(xiàng)研究［25］以產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌感染小鼠（最小致死量為107CFU·mL－1），感染后20和40min分別進(jìn)行噬菌體治療，動(dòng)物的存活率均為100%。進(jìn)一步說明噬菌體在由耐藥性細(xì)菌所引起的動(dòng)物模型中亦有很好的作用。Watanabe等［26］研究腸源性膿毒血癥動(dòng)物模型時(shí)發(fā)現(xiàn)：在腸道菌群失調(diào)后可由耐氨芐青霉素銅綠假單胞菌引起腸源性膿毒血癥，噬菌體經(jīng)口服后能完全清除腸道內(nèi)銅綠假單胞菌的繁殖，同時(shí)減輕局部和全身炎癥反應(yīng)，并能減少動(dòng)物的死亡率。Karumidze等［27］從環(huán)境中分離出6株克雷伯桿菌噬菌體，體外裂解實(shí)驗(yàn)顯示：有2株噬菌體（VB－K1p3和VB－K1p4）具有非常寬泛的裂解宿主細(xì)胞特性；其從格魯吉亞和英國的醫(yī)院共分離出123株肺炎克雷伯菌（包括多重耐藥株），來自英國的76%分離株和來自格魯吉亞的26%分離株對(duì)這2株噬菌體非常敏感。噬菌體的生長曲線表明：從噬菌體感染宿主菌到裂解細(xì)菌的時(shí)間一般為15～20min。

2.4 噬菌體療法的臨床應(yīng)用 由于噬菌體在動(dòng)物感染模型中取得了令人滿意的結(jié)果，因此噬菌體的安全性試驗(yàn)開始在人體上進(jìn)行。在一項(xiàng)長達(dá)12年的試驗(yàn)項(xiàng)目［28］中，將高濃度的葡萄球菌噬菌體應(yīng)用于人的鼻腔黏膜、口腔、皮下和靜脈，最終未發(fā)現(xiàn)明顯的副反應(yīng)。在瑞典進(jìn)行的正式安全性試驗(yàn)結(jié)果表明［29］：服用大腸埃希菌噬菌體的志愿者亦未出現(xiàn)安全性問題。最近由美國FDA批準(zhǔn)的Ⅰ期臨床試驗(yàn)［30］中，噬菌體用于治療因細(xì)菌反復(fù)感染（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌）造成的下肢靜脈性潰瘍，39名患者接受了為期12周的噬菌體治療，整個(gè)試驗(yàn)歷時(shí)24周，并未顯示噬菌體有安全性問題。2009年英國醫(yī)學(xué)和保健品協(xié)調(diào)署授權(quán)皇家耳鼻喉?？漆t(yī)院從事一項(xiàng)噬菌體治療慢性耳炎的Ⅰ期和Ⅱ期臨床研究［31］，慢性耳炎患者的病程均在數(shù)年以上，病原菌均為多重耐藥的銅綠假單胞菌，噬菌體的商品名稱為Biophage－PA，其含有6種針對(duì)不同血清型宿主菌的噬菌體，該噬菌體產(chǎn)品由美國Intralytic生物制劑公司提供。該研究采用隨機(jī)設(shè)計(jì)的雙盲試驗(yàn)，并應(yīng)用安慰劑進(jìn)行對(duì)照，觀察該噬菌體制劑的療效，結(jié)果顯示：噬菌體療法非常有效，而且也是安全的。

3 噬菌體療法的優(yōu)勢及局限性

噬菌體與抗生素比較有如下優(yōu)點(diǎn)［32－33］：① 噬菌體特異性強(qiáng)，只針對(duì)相應(yīng)的致病菌，而不會(huì)破壞機(jī)體的正常菌群。② 噬菌體療法的副作用少，抗生素則容易引起多種不良反應(yīng)。③ 噬菌體的指數(shù)增殖能力是噬菌體療法的一個(gè)顯著優(yōu)勢。在一個(gè)裂解周期內(nèi)，每個(gè)噬菌體會(huì)產(chǎn)生超過100個(gè)子代噬菌體。④ 噬菌體呈宿主依賴性，只在細(xì)菌感染的部位發(fā)揮作用，隨著宿主菌的清除，噬菌體不會(huì)殘留于體內(nèi)。⑤ 噬菌體制劑的研制與開發(fā)所需時(shí)間短、成本低。而新一代抗生素的研制周期一般約為10年。噬菌體治療亦存在局限性：① 噬菌體在血液和組織中存留，噬菌體作為異源物質(zhì)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可能抑制噬菌體使其失去清除細(xì)菌的能力。此外，機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system）的清除作用也會(huì)很快地將噬菌體清除。② 噬菌體的宿主譜窄，噬菌體裂解細(xì)菌的作用具有嚴(yán)格的宿主特異性，即某一種或型的噬菌體只能感染并裂解相應(yīng)種或型的細(xì)菌，對(duì)其他種或型的細(xì)菌不起作用。③噬菌體治療的劑量和時(shí)間有局限性，傳統(tǒng)的抗生素應(yīng)用越早越好，而噬菌體不可以過早使用。根據(jù)噬菌體治療的藥代動(dòng)力學(xué)原理解釋，只有在細(xì)菌達(dá)到一定密度的時(shí)候噬菌體才開始增殖，噬菌體接種過早或劑量不合適，可能會(huì)在其開始增殖之前就被機(jī)體清除掉，確定最佳接種時(shí)間和劑量將是噬菌體治療的關(guān)鍵［34］。④ 噬菌體攜帶一些毒素基因可能會(huì)給機(jī)體帶來不利影響，如大腸埃希菌的不耐熱腸毒素基因是噬菌體介導(dǎo)的，因此使用噬菌體前應(yīng)先純化，以降低毒素水平。⑤ 宿主菌對(duì)噬菌體的抗性，相關(guān)研究［33］表明：細(xì)菌可通過多種途徑抵抗噬菌體的侵襲，如吸附抑制、流產(chǎn)感染和溶原狀態(tài)的建立等。但隨著各種技術(shù)和方法的不斷改進(jìn)，上述不利因素可逐漸被克服，如采用多種噬菌體制成的混合制劑（雞尾酒）來治療某些常見的細(xì)菌感染；或利用分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)噬菌體裂解酶的基因工程產(chǎn)品，用來治療由多種血清型革蘭陽性球菌引起的感染。

面對(duì)細(xì)菌耐藥形勢的日益嚴(yán)峻，越來越多的微生物學(xué)專家和企業(yè)開始將目光轉(zhuǎn)向這種針對(duì)細(xì)菌的天然病毒，國際一些著名的醫(yī)藥公司開始對(duì)噬菌體產(chǎn)生濃厚的興趣，相信不久的將來會(huì)有更多的噬菌體產(chǎn)品走向市場。

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