南極磷蝦蛋白質(zhì)的分離特性及其組分分析

李芳，劉俊榮，梁姍姍，閆瑞霞

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116023)

南極磷蝦Euphausua superba是一種小型的甲殼類動(dòng)物。南極磷蝦資源豐富，生物總量為10 ～30億t，年可捕撈量為0.6 ～1億t［1］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)南極磷蝦加工利用的研究主要圍繞著蛋白質(zhì)、磷蝦油及甲殼素等三大組分開展［2-4］，此外，針對(duì)磷蝦酶也有相關(guān)的研究［5］。南極磷蝦蛋白質(zhì)含量豐富，為完全蛋白質(zhì)，富含人體所需的9種必需氨基酸(包括嬰兒所需的組氨酸)，其必需氨基酸含量符合1985年FAO/WHO/UNU 報(bào)告中所推薦的氨基酸攝入量［6］。Gigliotti等［2］對(duì)磷蝦蛋白質(zhì)品質(zhì)包括消化率、生物學(xué)價(jià)值、凈蛋白質(zhì)利用率等的研究表明，磷蝦蛋白質(zhì)與酪蛋白無(wú)顯著性差異。因此，磷蝦蛋白質(zhì)為高品質(zhì)蛋白質(zhì)源。海洋蛋白質(zhì)作為原料可加工成魚糜和蛋白粉或魚粉供人類食用或用作飼料。但魚糜的局限性在于對(duì)原料蛋白質(zhì)要求苛刻，制約了一部分變性海洋蛋白質(zhì)的利用［7］。利用pH調(diào)節(jié)法制備分離蛋白是近幾年探討的一種方法，該方法不需要除去水產(chǎn)動(dòng)物的骨骼和皮等，可以回收肌漿蛋白質(zhì)并提高蛋白質(zhì)的回收率，能有效地去除中性脂肪和膜脂，且回收蛋白質(zhì)的功能性較好［8］。本研究中，作者以冷凍南極磷蝦為原料，采用pH調(diào)節(jié)法嘗試南極磷蝦蛋白質(zhì)分離回收的可行性，旨在為磷蝦資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供，原料凍藏一年左右，冷凍塊狀運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，立即放入冰柜(-20 ℃)中冷凍保存。

試驗(yàn)儀器:DS21 型高速勻漿機(jī)，為上海樣品模型廠產(chǎn)品，電機(jī)輸出功率為200 W(220 V，50 Hz);GL-21M 高速冷凍離心機(jī)，為湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;Sartorius 型pH 計(jì)(PB-10)，為賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品;721 型分光光度計(jì)，為上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的溶出、分離與回收

1)南極磷蝦的預(yù)處理。取南極磷蝦150 g，于4 ℃下解凍，解凍后加入9 倍質(zhì)量的去離子水混合，以5 000 r/min 勻漿2 min，過濾得到南極磷蝦勻漿和蝦殼殘?jiān)?。由于南極磷蝦內(nèi)源蛋白酶極其活躍，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溫度控制在4 ℃。

2)蛋白質(zhì)的溶解。南極磷蝦勻漿pH 設(shè)置為1.5 ～12.0，以0.5 為pH 變化梯度。將勻漿分為兩份，一份用2 mol/L HCl 依次調(diào)到1.5(酸處理)，一份用2 mol/L NaOH 依次調(diào)到12.0(堿處理)，在4 ℃下以10 000 g 離心20 min，得到不同pH 下的溶出物和未溶出物。

3)蛋白質(zhì)的回收。用2 mol/L HCl 或2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)南極磷蝦溶出物至等電點(diǎn)，在4 ℃下以10 000 g 離心20 min，得到分離蛋白和未回收溶出物。

1.2.2 分析測(cè)定

1)一般化學(xué)組成的測(cè)定。采用直接干燥法(GB/T5009.3-2003)測(cè)定水分含量，采用灼燒稱重法(GB/T5009.4-2003)測(cè)定粗灰分含量，采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2003)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，采用三氯乙酸沉淀法測(cè)定非蛋白態(tài)氮含量，采用索氏抽提法(GB/T5009.6-2003)測(cè)定粗脂肪含量。每種組分測(cè)定3次，取其平均值。

2)蛋白質(zhì)的溶解度和回收率。采用雙縮脲法［9］測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出不同pH 下南極磷蝦蛋白質(zhì)的溶解度和回收率曲線，其計(jì)算公式為

其中:A 為離心中層清液蛋白質(zhì)含量(mg)，A=離心中層清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)×離心中層清液體積(mL);A1為第一次離心中層清液蛋白質(zhì)含量(mg);A2為第二次離心上清液蛋白質(zhì)含量(mg);C 為總蛋白質(zhì)含量(mg)，C=總蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)×勻漿體積(mL)。

3)SDS-PAGE 電泳。用SDS-PAGE 電泳測(cè)定用酸堿法提取過程中不同階段的蛋白質(zhì)組成。選取pH 為1.5和12.0 兩個(gè)點(diǎn)。分析樣品包括勻漿液、溶出物、未回收溶出物及分離蛋白。樣品中加入3倍體積的4×SDS 樣品緩沖液，混合后加入總體積為5%的β-巰基乙醇，在95 ℃下水浴10 min。樣品上樣量為10 ～15 μL，用120 g/L 分離膠、50 g/L 濃縮膠配制膠板。用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，脫色。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷凍南極磷蝦的化學(xué)組成

經(jīng)測(cè)定，冷凍南極磷蝦的基本組成成分含量:水分79.37%、總脂肪3.22%、粗蛋白質(zhì)11.45%、粗灰分3.03%。經(jīng)分析表明，南極磷蝦非蛋白態(tài)氮含量為26.7%(干基)。

2.2 分離過程中蛋白質(zhì)溶解度的變化

從圖1可見:當(dāng)pH 為1.5 ～4.5 時(shí)，溶解度呈逐漸下降趨勢(shì);當(dāng)pH 為4.5 ～12.0 時(shí)，溶解度呈逐步上升趨勢(shì)。即在酸性或堿性pH 時(shí)，蛋白質(zhì)帶同種正電荷或負(fù)電荷，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥和蛋白質(zhì)與水分子的結(jié)合促使蛋白質(zhì)溶解［10］。在極端pH 條件下，如pH 為1.5和pH 為12.0 時(shí)，具有強(qiáng)烈的靜電排斥，使蛋白質(zhì)分子之間難以聚合沉淀，同時(shí)，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合，溶解度較高;當(dāng)pH 為4.5(等電點(diǎn))時(shí)，蛋白質(zhì)凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子之間缺少靜電排斥，促進(jìn)了蛋白質(zhì)疏水作用和蛋白質(zhì)聚合，蛋白質(zhì)溶解度最低［11］。酸性溶液中蛋白質(zhì)溶解度在pH 為1.5 時(shí)最大(61.5%)，堿性溶液中蛋白質(zhì)溶解度在pH 為12.0 時(shí)最大(66.1%);當(dāng)pH 為4.5 時(shí)溶解度最小(15.8%)。

圖1 南極磷蝦蛋白質(zhì)溶解度隨pH 的變化曲線Fig.1 Changes in protein solubility with pH value in Antarctic krill

2.3 分離過程中蛋白質(zhì)回收率的變化

從圖2可見:南極磷蝦蛋白質(zhì)回收率的變化趨勢(shì)與溶解度的變化趨勢(shì)一致。當(dāng)pH 為1.5 ～4.5時(shí)，回收率呈逐漸下降趨勢(shì);當(dāng)pH 為4.5 ～12.0時(shí)，回收率呈逐步上升趨勢(shì)。酸性溶液中蛋白質(zhì)回收率在pH 為1.5 時(shí)最大(49.8%)，堿性溶液中蛋白質(zhì)回收率在pH 為12.0 時(shí)最大(45.7%);當(dāng)pH 為4.5 時(shí)回收率最小(0.3%)。

與魚類蛋白質(zhì)回收率(60% ～80%)相比［8，12］，南極磷蝦蛋白質(zhì)回收率相對(duì)較低。根據(jù)Chen等［13］的研究結(jié)果，用酸堿處理法只能部分回收水溶性肌漿蛋白質(zhì)，而且肌漿蛋白質(zhì)的回收與離子強(qiáng)度有關(guān)。南極磷蝦含有較高濃度的肌漿蛋白質(zhì)［14］，本研究中原料冷凍保藏時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致自溶酶對(duì)蛋白質(zhì)有一定的降解作用(圖3)，這就可以在一定程度上解釋了南極磷蝦蛋白質(zhì)回收率低的原因。此外，還有一些實(shí)際操作中的影響因素，如勻漿轉(zhuǎn)速、離心轉(zhuǎn)速以及操作過程中對(duì)蛋白質(zhì)的損失等。

圖2 南極磷蝦蛋白質(zhì)回收率隨pH 的變化曲線Fig.2 Effect of pH on recovery of Antarctic krill protein

2.4 蛋白質(zhì)分子量的分布特性

圖3和圖4 為用酸、堿處理法回收和分離蛋白前后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的分布圖譜。南極磷蝦勻漿蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為小分子量蛋白質(zhì)，主要有4 條特征帶，分布在相對(duì)分子質(zhì)量為 80 000、45 000、40 000、32 000 處。

對(duì)比圖3和圖4可以得出:用酸處理時(shí)，可以回收大部分溶出物蛋白質(zhì)組分，未回收溶出物的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為40 000 左右;用堿處理時(shí)，溶出物中蛋白質(zhì)組分較多，但分離蛋白中蛋白質(zhì)組分較少，仍有多種蛋白質(zhì)組分未回收，未回收溶出物蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布在80 000和35 000～45 000 處。

圖3 酸處理和堿處理過程中不同樣品的蛋白質(zhì)組成Fig.3 Protein composition of different samples in acid and alkaline treatments by SDS-PAGE

圖4 酸處理和堿處理分離蛋白的蛋白質(zhì)組成Fig.4 Protein composition of protein isolates from acid and alkaline solubilization process by SDS -PAGE

Kawamura等［15］研究表明，磷蝦蛋白質(zhì)自溶非常迅速，尤其是肌球蛋白重鏈的降解，24 h 后大部分蛋白質(zhì)降解為低分子量物質(zhì)。本研究中所用原料因長(zhǎng)期凍藏，其自溶作用不言而喻，研究分析結(jié)果也佐證了這一點(diǎn)。

2.5 分離過程中蛋白質(zhì)的分布特性

由于南極磷蝦回收率較低，針對(duì)分離過程中南極磷蝦含氮物的分布進(jìn)行跟蹤分析，包括南極磷蝦、蝦殼殘?jiān)?、未溶出物、未回收溶出物及分離蛋白等五部分。

從表1可見，分離過程中南極磷蝦含氮物質(zhì)主要分布在未回收溶出物和分離蛋白中。其中，用酸、堿處理法回收分離的蛋白質(zhì)得率分別為37.76%和37.13%;酸、堿處理中未回收溶出物中的含氮物質(zhì)占很大的比例，分別為31.89%和37.13%，可解釋為冷凍南極磷蝦的自溶作用導(dǎo)致大量非蛋白態(tài)氮產(chǎn)生，因而無(wú)法在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處絮凝回收;酸、堿處理中原料處理產(chǎn)生的蝦殼殘?jiān)胁糠趾?，分別占原料總氮的7.13%和9.48%;堿處理的蛋白質(zhì)溶出效果要明顯好于酸處理，酸、堿處理中未溶出物中粗蛋白質(zhì)的含量分別為15.52%和2.57%。

由于本試驗(yàn)原料為冷凍南極磷蝦，自溶酶降解作用已積累到一定程度。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用pH調(diào)節(jié)法分離回收蛋白質(zhì)的得率較低，因此，pH 調(diào)節(jié)法不適用于冷凍南極磷蝦蛋白質(zhì)的分離回收。

表1 分離過程中南極磷蝦含氮物質(zhì)的分布(干基)Tab.1 Profile of Antarctic krill nitrogenous compounds in the separation process(dry basis) w/%

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