瑞士乳桿菌X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

郭宇星，祝 倩，朱 坤，周慧敏，孫楊贏,2，曾小群,2，潘道東,2,*

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽是一類氨基酸序列和肽鏈長(zhǎng)度各不相同的多肽，具有降低血壓的功效，在功能性食品的開發(fā)中，逐漸已成為研究熱點(diǎn)[1-2]。已有較多關(guān)于利用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)發(fā)酵法制備ACE抑制肽的報(bào)道，因?yàn)槿鹗咳闂U菌相比于其他乳酸菌具有較強(qiáng)的蛋白水解能力，制作的酸乳中含有高活性的ACE抑制肽[3-4]。瑞士乳桿菌能夠水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽，與其蛋白水解系統(tǒng)有關(guān)，瑞士乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)包括細(xì)胞壁蛋白酶(CEP)，其作用是把蛋白質(zhì)水解成一系列的寡肽，然后由寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Opp A)、二肽和三肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dtp P和Dtp T)運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，由胞內(nèi)肽酶(包括肽鏈內(nèi)切酶、氨肽酶、二肽三肽酶、Pro-特異性肽酶)進(jìn)一步將短肽水解為氨基酸或更小的肽類[5-8]。ACE抑制肽在水解過程中產(chǎn)生，但ACE抑制肽具體由哪種酶特異性水解乳蛋白產(chǎn)生尚不清楚。

從以往的報(bào)道看，ACE抑制肽的蛋白(Pro)含量高，含Pro的ACE抑制肽的活性要高于不含Pro的ACE抑制肽[9]。比如，1995年，Nakamura等[10-11]用Lactobacillushelveticus和Saccharomyces cerevisiae制作了一種Calpis酸乳飲料，然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓小鼠(SHR)長(zhǎng)期服用Calpis后，可抑制血壓上升，隨后研究人員從Calpis中提取出兩種具有ACE抑制活性的多肽VPP和IPP，證明這兩種肽具有降血壓功能。Pan等[12]用Lactobacillus helveticusJCM1004水解乳蛋白，鑒定出了2個(gè)ACE抑制肽，為IPP和VPP。1999年，Yamamoto等[13]從Lactobacillus helveticusCPN4發(fā)酵的酸奶產(chǎn)品中找到了1條有抗高血壓活性的二肽：Tyr-Pro。在乳蛋白中Pro含量較多，在αs1-CN中Pro含有8.5%，在β-CN中Pro含有16.7%[5]。瑞士乳桿菌肽酶中，Pro-特異性肽酶可特異性地水解含有Pro的肽鍵，瑞士乳桿菌X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶(X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase，Pep X)為Pro特異性肽酶的一種，主要水解多肽釋放出X-Pro二肽。因此，本實(shí)驗(yàn)擬提取瑞士乳桿菌Pep X，并進(jìn)行分離純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期能全面了解酶的性質(zhì)，為后期研究瑞士乳桿菌蛋白酶特異性水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽及ACE抑制肽的開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑞士乳桿菌ATCC 15019(Lactobacillus helveticusATCC 15019) 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection)；H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate 瑞士巴亨公司；Sephacryl S-300 HR 美國(guó)Pharmacia公司；SDSPAGE低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、聚乙二醇20000 南京金慶祥貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱 廣東醫(yī)療儀器廠；PHS-3C精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠；紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；CL-22M高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀(槽)北京市六一儀器廠；分離層析裝置 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌菌體制備

取瑞士乳桿菌ATCC 15019凍干粉接種于液體MRS培養(yǎng)基，連續(xù)活化3代。然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期取出后4℃、4500r/min離心20min，收集菌體。菌體用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液洗滌，4℃、4500r/min離心20min后棄上清液，收集菌體。重復(fù)洗滌3次后，收集瑞士乳桿菌菌體備用。

1.3.2 超聲波破碎菌體提取Pep X粗酶液

瑞士乳桿菌菌體用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)重新懸浮后進(jìn)行超聲波破碎。菌體與緩沖液的比例為1:42(m/V)。超聲波破碎條件為功率300W，破碎時(shí)間為26min(工作時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s)，冰浴冷卻。超聲波破碎后4℃、4500r/min離心20min，取上清液，即為粗酶液。

1.3.3 Pep X活性測(cè)定

H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate為Pep X的底物。取0.02mL配制成16.4mmol/L的H-Gly-Pro-pNA· p-tosylate、酶液1mL、50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)2mL混合，在37℃條件下保溫2h后取出，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照管是以蒸餾水代替酶液同樣條件操作。酶活定義為：在37℃時(shí)，每小時(shí)吸光度上升0.01為1個(gè)活力單位。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[14]。

1.3.5 Pep X的分離純化

1.3.5.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

將按1.3.2節(jié)步驟制取的粗酶液進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷溫度至0～5℃，然后緩慢加入40%碾細(xì)的硫酸銨。4℃靜置過夜后再于4℃、6000r/min離心20min，收集沉淀，上清液再加入60%硫酸銨，4℃靜置過夜，離心后收集沉淀，按以上步驟操作，分別獲得40%、60%、80%、100%硫酸銨的沉淀。沉淀利用透析進(jìn)行除鹽，透析袋截留分子質(zhì)量為14000D，除鹽后樣品用聚乙二醇20000濃縮，然后測(cè)定每級(jí)硫酸銨沉淀的蛋白含量和Pep X酶活性。

1.3.5.2 Sephacryl S-300 HR分離

選用的層析柱為1.6cm×50cm，硫酸銨沉淀后酶液樣品上樣量為3mL，蒸餾水洗脫，流速20mL/h，5min收集1管。采用上海滬西核酸蛋白檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為280nm。按照?qǐng)D譜收集組分，各組分分別測(cè)定酶活性及蛋白含量。

1.3.6 非變性-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法切膠制備Pep X

1.3.6.1 酶譜法確定Pep X條帶

非變性-PAGE電泳中分離膠與濃縮膠制備方法參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

a板：在10%分離膠中加入1%的Pep X的底物H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate，5%濃縮膠。上樣樣品Sephacryl S-300 HR分離的酶液后進(jìn)行非變性-PAGE電泳，電泳完畢后在50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液中37℃保溫24h，讓酶與底物充分反應(yīng)。保溫完畢后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h，充分脫色。b板：不加H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate，電泳條件同上。a板與b板的條帶作對(duì)比，a板上消失的蛋白帶即為Pep X。

1.3.6.2 切膠回收Pep X

經(jīng)1.3.6.1節(jié)確定Pep X條帶后，切下b板上相應(yīng)的Pep X酶條帶，把膠充分碾碎后加入50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液過夜后4000r/min離心15min，取上清液，重復(fù)制備至后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的酶量。上清液冷凍干燥后即為純化的Pep X。純化的Pep X測(cè)定分子質(zhì)量及研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1.3.7 SDS-PAGE測(cè)定酶分子質(zhì)量

[15]進(jìn)行，蛋白Marker選用低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.3.8 Pep X酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.8.1 Pep X最適pH值測(cè)定

用pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解Pep X，然后按照1.3.3節(jié)測(cè)定酶活。

1.3.8.2 Pep X最適溫度測(cè)定

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，在28、33、37、41、45℃條件下保溫2h測(cè)定酶活。

1.3.8.3 Pep X的pH值穩(wěn)定性

用pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解Pep X，保溫1h，然后測(cè)定酶活。

1.3.8.4 Pep X的熱穩(wěn)定性

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，然后在25、35、45、55、65、75、85℃條件下保溫1h，取出后測(cè)定酶活。

1.3.8.5 蛋白酶抑制劑和金屬離子對(duì)酶活力的影響

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，分別加入1mmol/L和10mmol/L的金屬離子，包括Ca2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、K+、Na+，1mmol/L和10mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA。在37℃孵浴2h后，測(cè)定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pep X的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

表1 (NH4)2SO4飽和度對(duì)Pep X提取的影響(±s)Table 1 Effect of (NH4)2SO4 saturation degree on the purification of Pep X (±s)

表1 (NH4)2SO4飽和度對(duì)Pep X提取的影響(±s)Table 1 Effect of (NH4)2SO4 saturation degree on the purification of Pep X (±s)

硫酸銨飽和度/% 0～40 40～60 60～80 80～100 Pep X酶活力/(U/mL) 22.18±0.35 18.20±0.30 4.60±0.06 2.90±0.15 Pep X酶比活力/(U/mg) 9.52±0.15 7.65±0.13 1.82±0.02 1.30±0.07沉淀蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(mg/mL)2.33±0.01 2.38±0.02 2.53±0.01 2.24±0.01

硫酸銨鹽析是一種較常見且有效的蛋白粗提方式。當(dāng)鹽濃度高到一定程度的時(shí)候，過多的鹽會(huì)跟蛋白質(zhì)疏水表面爭(zhēng)奪水分子，以至于蛋白質(zhì)疏水表面傾向于相互作用形成聚合物沉淀。由表1可知，Pep X在0%～40%、40%～60%硫酸銨飽和度條件下，蛋白酶活力最高，酶比活力也最高，因此選擇0%～60%為合適的硫酸銨鹽析飽和度。

2.1.2 Sephacryl S-300 HR凝膠層析

圖1 Pep X的Sephacryl S-300 HR層析圖Fig.1 Sephacryl S-300 chromatography of Pep X

表2 Sephacryl S-300 HR 各峰的Pep X活性(±s)Table 2 Pep X activity of Sephacryl-S-300 HR (±s)

表2 Sephacryl S-300 HR 各峰的Pep X活性(±s)Table 2 Pep X activity of Sephacryl-S-300 HR (±s)

組分 1 2 3 4 Pep X酶活力/(U/mL) 5.22±0.07 6.55±0.14 10.23±0.20 6.15±0.22 Pep X酶比活力/(U/mg) 4.71±0.06 4.10±0.09 11.56±0.23 32.72±1.18蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(mg/mL)1.11±0.02 1.60±0.05 0.88±0.04 0.19±0.02

由圖1可知，0%～60%硫酸銨鹽析粗提物共分離出4個(gè)組分的酶活力。由表2可知，第3個(gè)組分Pep X酶活相對(duì)較高，酶比活力也較高，第4組分酶比活力雖然很高，但是提取得到的Pep X量太少，所以選擇蛋白含量較高、酶活也相對(duì)較高的第3組分進(jìn)行下一步分離純化。

2.1.3 Pep X的分離純化

圖2 PepX的非變性PAGE和SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Native-PAGE and SDS-PAGE of Pep X

圖2 b為Sephacryl S-300 HR凝膠層析分離后第3組分的非變性PAGE電泳圖譜，可見有4條蛋白帶。圖2a為電泳時(shí)在分離膠中加入Pep X的底物的非變性PAGE電泳圖譜，可發(fā)現(xiàn)有1條蛋白帶消失。根據(jù)1.3.6.2節(jié)方法切膠回收Pep X，測(cè)定酶比活力為62.24U/mg。然后用SDSPAGE檢測(cè)分子質(zhì)量及純度，由圖2c可知，經(jīng)切膠純化后的Pep X為單條帶，單體分子質(zhì)量推測(cè)約為26kD。

表3 Pep X純化過程及結(jié)果Table 3 Summary of the purification procedures of Pep X

通過硫酸銨鹽析、Sephacryl S-300 HR層析、非變性-PAGE切膠回收蛋白純化了瑞士乳桿菌Pep X，最后得到了電泳純Pep X。由表3可知，其回收率為4.74%，提純倍數(shù)為29.39。

2.2 Pep X的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適酶反應(yīng)pH值

圖3 pH值和溫度對(duì)Pep X活性的影響。Fig.3 Effects of pH and temperature on Pep X activity

由圖3a可知，Pep X的最適反應(yīng)pH值為6.0～7.0，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，酶活性最高，將其作為相對(duì)酶活力100%，pH值為9.0時(shí)，相對(duì)酶活力下降至15%。

2.2.2 最適酶反應(yīng)溫度

由圖3b可知，當(dāng)溫度在37～41℃時(shí)，Pep X的酶活力較高，其中37℃時(shí)為最高。

2.2.3 pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

由圖3c可知，以不同pH值的緩沖液處理Pep X，保溫1h，Pep X的酶活力受到一定影響，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，Pep X酶活力下降至10%，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，殘留酶活力為63%，這說明Pep X在酸性條件下比較穩(wěn)定。

2.2.4 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

由圖3d可知，溫度對(duì)Pep X酶活力的穩(wěn)定性有一定影響。當(dāng)Pep X在55℃保溫30min時(shí)，殘留酶活力顯著下降至40%，當(dāng)酶在85℃保溫30min時(shí)，殘留酶活力下降至20%，這說明Pep X耐熱性較差。

2.2.5 抑制劑和金屬離子對(duì)酶活力的影響

由表4可知，Co2+對(duì)Pep X的活性有激活作用，Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+對(duì)Pep X活性有強(qiáng)烈的抑制作用，K+、Na+對(duì)蛋白酶活性影響不大，其他金屬離子都有一定的抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)Pep X抑制作用較大，在PMSF濃度為10mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為15.103%，金屬蛋白酶抑制劑EDTA對(duì)Pep X酶活力也有一定的抑制，說明Pep X為金屬依賴性的絲氨酸蛋白酶。

3 討 論

關(guān)于Pep X的提取已有相關(guān)報(bào)道。如Vesanto等[16]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus helveticus的Pep X最適酶反應(yīng)pH值為6.5，最適酶反應(yīng)溫度為45℃；Pep X是一個(gè)二聚體，分子質(zhì)量為165kD，Cu2+、Cd2+和Zn2+抑制Pep X活性，EDTA也能夠抑制Pep X的活性，PMSF強(qiáng)烈抑制Pep X的活性，說明Pep X是一個(gè)金屬依賴性的絲氨酸肽酶。本實(shí)驗(yàn)純化Pep X經(jīng)過SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)單體蛋白分子質(zhì)量約在26kD左右，與Vesanto等[16]報(bào)道的有一些差異，所以考慮Pep X也可能以多聚體形式存在，具體還將進(jìn)一步研究。Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricusLBU-147的Pep X為三聚體，單體的分子質(zhì)量經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定為90kD，最適的pH值為6.5，最適溫度為50℃，Hg2+、Cu2+、Fe3+強(qiáng)烈抑制其活性[17]。Lactobacillus sanfranciscensisCB1的Pep X為單聚體，SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量為49.2～56kD，最適酶反應(yīng)pH值為6.0，最適酶反應(yīng)溫度為30℃，Zn2+、Hg2+和Mn2+抑制酶的活性[18]。來(lái)源于Streptococcus thermophilusACA-DC4的Pep X分子質(zhì)量為80kD，最適酶反應(yīng)pH值為7.0，最適酶反應(yīng)溫度為50℃，PMSF強(qiáng)烈抑制其活性[19]。Degraeve等[20]對(duì)Lactobacillus helveticusITG LH1的Pep X進(jìn)行了純化，采用離子交換層析和親和層析的方法純化了Pep X，Pep X為單體結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量為140kD，最適酶反應(yīng)pH值為7.0，酶反應(yīng)溫度為40℃，但在50℃以上活性降低。0.1mmol/L HgCl2、1mmol/L SnCl2和2.5mmol/L CuCl2完全抑制其活性，同時(shí)還可以被PMSF抑制活性。從Pep X的研究報(bào)道可以看出，不同乳酸菌的Pep X在分子質(zhì)量、最適酶反應(yīng)pH值和最適酶反應(yīng)溫度都有一定的差別。但Pep X的活性都受金屬離子的影響，并且能被PMSF抑制其活性，說明乳酸菌的Pep X是金屬依賴性的絲氨酸肽酶。

本實(shí)驗(yàn)通過硫酸銨沉淀、Sephacryl S-300 HR層析、非變性-PAGE切膠回收蛋白純化了瑞士乳桿菌的Pep X，得到了電泳純Pep X，酶比活力為62.24U/mg。瑞士乳桿菌Pep X經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定單體分子質(zhì)量大約為26kD，最適酶反應(yīng)pH值為7.0，最適酶反應(yīng)溫度為37℃，在酸性條件下較穩(wěn)定，耐熱性較差。Co2+對(duì)Pep X有激活作用，Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+對(duì)Pep X有強(qiáng)烈的抑制作用，金屬蛋白酶抑制劑EDTA、絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)Pep X有一定的抑制作用，說明Pep X金屬依賴性的絲氨酸肽酶。后期將擬利用純化的Pep X水解乳蛋白，對(duì)水解后產(chǎn)物進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定，分離純化水解產(chǎn)物并測(cè)定氨基酸序列，如能確定Pep X可特異性水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽，可作為工具酶為今后ACE抑制肽的規(guī)?；苽涮峁┮欢ǖ膽?yīng)用基礎(chǔ)。

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