瓠瓜胰蛋白酶抑制劑水提工藝條件優(yōu)化及不同部位胰蛋白酶抑制劑活性

邵 悅，張 琪，張 程，馬 勇*

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧 錦州 121013)

瓠瓜又名長瓠、扁蒲、瓠子、蒲瓜、葫蘆等，屬葫蘆科一年生草本植物[1]。瓠瓜中含有胰蛋白酶抑制劑，它能與相應(yīng)的蛋白水解酶形成一定的動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動[2]。據(jù)報道，大豆[3]、豆豉胰蛋白酶抑制劑能促進(jìn)胰腺釋放胰島素，從而降低血糖濃度[4]；大黃中胰蛋白酶抑制劑具有抗腫瘤、保肝利膽、改善腎功能、活血止血、降血脂等多方面的作用[5]。目前，對瓠瓜的研究主要集中在育種和種植[6-8]方面，對瓠瓜中脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等常見成分的測定也有報道[9-12]，對于瓠瓜中胰蛋白酶抑制劑的研究，國內(nèi)外報道較少。本實(shí)驗從瓠瓜肉、瓤、籽等不同部位中提取胰蛋白酶抑制劑，并進(jìn)行活性和含量的測定[13]，但由于瓠瓜皮、葉、莖的色澤較深，難于脫色，不便測定，本實(shí)驗未作深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮嫩瓠瓜采自錦州閭山。

牛胰蛋白酶(1:250) 上海維編科貿(mào)有限公司；苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺(BAPNA，純度≥98%) 上海三杰生物技術(shù)有限公司；大豆蛋白酶抑制劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜、三-羥甲基-氨基甲烷(Tris)、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

緩沖溶液：稱取Tris 3.025g、CaCl2·H2O 1.26g，溶于400mL去離子水中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH值，使溶液在37℃時的pH值為8.2，以去離子水溶解并稀釋至500mL。BAPNA[7]溶液：稱取BAPNA 20mg溶于0.5mL二甲基亞砜中，并將緩沖溶液預(yù)熱至37℃作為溶劑將上述試劑稀釋至50mL。胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶10mg，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶，用0.001mol/L鹽酸[7]20mL溶解，以去離子水稀釋定容并混勻，活性單位數(shù)≥2500U/mg，pH5.0～7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

RE 52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PB-10 Sartorius酸度計、TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法[13]

1.3.1 胰蛋白酶抑制劑抑制率測定

以BAPNA為底物，建立一個特定的酶反應(yīng)體系。胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410nm波長處吸光度增加；胰蛋白酶抑制劑加入上述體系后，抑制了胰蛋白酶的活性，使吸光度增加的幅度有所減少，以其減少程度表示抑制劑的抑制能力，從而計算出抑制活性，其中抑制活性定義為：每克蛋白質(zhì)抑制純胰蛋白酶的毫克數(shù)[14-15]。

分別取鮮嫩瓠瓜肉、瓤、籽20g，磨碎，加入蒸餾水150mL，分別調(diào)節(jié)pH值至3、5、7、9、11，水浴加溫提取。抽濾，減壓濃縮至20mL，1000r/min離心20min，上清液即為樣品提取液。

在10mL反應(yīng)體系中，加1mL樣品提取液，加蒸餾水至2mL，加入2mL胰蛋白酶溶液，振蕩混勻，加入5mL BAPNA溶液，恒溫37℃，反應(yīng)10min后，立即加入1mL 30%三氯乙酸混勻，以終止反應(yīng)，于410nm波長處測定吸光度。同時，以對應(yīng)的空白溶液作為參照。按照式(1)計算抑制率。

式中：η為樣品提取液對胰蛋白酶的抑制率/%；A0為胰蛋白酶溶液的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度；Ab為樣品溶液對照空白的吸光度。

1.3.2 胰蛋白酶抑制劑活性測定[16-17]

在空白試管中加入2mL蒸餾水、5mL BAPNA溶液，37℃水浴恒溫10min后，加入1mL乙酸溶液、2mL胰蛋白酶溶液，混勻，過濾。

在酶反應(yīng)試管中，分別加入稀釋后的樣品溶液1.0、2.0mL，各加入蒸餾水至2mL，水浴恒溫37℃。加入2mL胰蛋白酶溶液，振蕩混勻；加入5mL BAPNA溶液，37℃水浴恒溫10min后，加入1mL 30%三氯乙酸溶液，混勻，以終止反應(yīng)，過濾。用光程1cm比色皿，于410nm波長處測定吸光度，以對應(yīng)的空白溶液作為參照。按式(2)、(3)計算胰蛋白酶抑制劑活性(TIU)和樣品稀釋液中胰蛋白酶抑制劑活性(T)。

式中：A標(biāo)準(zhǔn)為未抑制的酶反應(yīng)體系的吸光度；A樣品為抑制的酶反應(yīng)體系的吸光度。

式中：TIU1.0、TIU2.0為分別加入稀釋后的樣品溶液1.0、2.0mL的胰蛋白酶抑制劑活性。因瓠瓜籽、肉和瓤均為固體，在此以TIU/g為抑制活性單位。

1.3.3 胰蛋白酶抑制劑含量測定[18-19]

采用BAPNA法測定瓠瓜胰蛋白酶抑制劑含量，配制5、10、20、30、40μg/mL的胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，以試劑空白作為參照溶液，在410nm波長處測定吸光度，測定其對胰蛋白酶的抑制率。以胰蛋白酶抑制劑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=2.0393x－0.3082(R2=0.9994)，從而計算出樣品中胰蛋白酶抑制劑的含量。

1.3.4 瓠瓜胰蛋白酶抑制劑提取單因素試驗[20]

1.3.4.1 溫度的影響

取磨碎的鮮嫩瓠瓜肉20g，按料液比1:6(m/V)加入蒸餾水120mL，pH7，溫度分別為50、60、70、80、90、100℃，提取1h，過濾、離心后取上清液，減壓濃縮到一定體積后測定對胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.2 料液比的影響

取磨碎的鮮嫩瓠瓜肉20g，pH7，溫度70℃，料液比分別按1:2、1:4、1:6、1:8、1:10加入蒸餾水，提取1h，過濾、離心后取上清液，減壓濃縮到一定體積后測定對胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.3 pH值的影響

取磨碎的鮮嫩瓠瓜肉20g，在70℃條件下，料液比按1:6加入120mL蒸餾水，pH值分別為4、5、6、7、8、9的條件下提取1h，過濾、離心后取上清液，減壓濃縮到一定體積后測定對胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.4 時間的影響

取磨碎鮮嫩瓠瓜肉20g，溫度為70℃，料液比按1:6加入120mL蒸餾水，pH7，提取時間分別為0.5、1、2、3、4h，過濾、離心后取上清液，減壓濃縮到一定體積后測定對胰蛋白酶的抑制率。

1.3.5 瓠瓜胰蛋白酶抑制劑提取正交試驗

以胰蛋白酶活性大小為指標(biāo)，從溫度、pH值、料液比、提取時間等條件中，選擇對胰蛋白酶抑制劑提取率有顯著影響的3項因素，進(jìn)行L9(33)正交試驗，探索從瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制劑最佳條件。

1.3.6 測定瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制劑的含量及活性

1.3.6.1 瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制劑活性的測定

分別取鮮嫩瓠瓜瓤、肉、籽的樣品溶液，按1.3.2節(jié)方法測定其活性。

1.3.6.2 瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制劑含量測定

分別取鮮嫩瓠瓜瓤、肉、籽的樣品溶液，按1.3.3節(jié)方法測定其含量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到不同部位的胰蛋白酶抑制劑的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 提取溫度對提取液抑制率的影響Fig.1 Influence of temperature on trypsin inhibitor activity of extracts

由圖1可知，隨著提取溫度的上升，胰蛋白酶抑制劑的抑制率逐漸增大；當(dāng)樣品的提取溫度達(dá)到70℃時，抑制率達(dá)到最高；繼續(xù)升高溫度，胰蛋白酶抑制劑的活性受到抑制，使得抑制率逐漸降低。故選取提取溫度70℃。

圖2 料液比對提取液抑制率的影響Fig.2 Influence of solid-to-solvent ratio on trypsin inhibitor activity of extracts

由圖2可知，隨著加入蒸餾水的量不斷增多，抑制率也隨之增加，當(dāng)料液比達(dá)到1:6時，抑制率達(dá)到最大且相對穩(wěn)定，繼續(xù)加入蒸餾水時，抑制率無明顯變化。故選擇料液比1:6。

圖3 pH值對提取液抑制率的影響Fig.3 Influence of extraction pH on trypsin inhibitor activity of extracts

由圖3可知，隨著pH值的增大，抑制率逐漸增大，到 pH7時達(dá)到最大，繼續(xù)增大pH值時，抑制率降低。因此，選擇提取的pH值為7。

圖4 提取時間對提取液抑制率的影響Fig.4 Influence of extraction time on trypsin inhibitor activity of extracts

由圖4可知，在提取1h后提取液的抑制率沒有太大的變化。綜合考慮后選用提取時間為1h，并不將其作為正交因素。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用料液比、提取溫度、pH值三因素進(jìn)行L9(33)正交試驗，以測定樣品提取液胰蛋白酶抑制劑抑制率為指標(biāo)，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表1。

表1 L9(33)正交試驗結(jié)果Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

由表1極值R可以看出，各因素對結(jié)果的影響次序為B＞C＞A，即pH值對抑制率影響最大，料液比次之，溫度影響最小。由K值可以看出最優(yōu)組合是A2B3C1，即最佳提取條件為：pH8、料液比1:4、提取溫度70℃、提取時間1h，此條件下獲得的抑制率最高達(dá)36.45%。

2.3 瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制劑含量及活性測定

2.3.1 抑制劑含量測定結(jié)果

由圖5可知，瓠瓜籽中胰蛋白酶抑制劑的含量最高為38.66μg/mL，瓠瓜肉中的含量次之為37.06μg/mL，瓠瓜瓤中的含量最少為25.33μg/mL。瓠瓜籽中的胰蛋白酶抑制劑含量最高是由于瓠瓜籽中水分含量很少，蛋白質(zhì)含量較高。

圖5 不同部位胰蛋白酶抑制劑含量Fig.5 Trypsin inhibitor content of different parts of gourd

2.3.2 抑制劑活性測定結(jié)果

圖6 不同部位胰蛋白酶抑制劑活性Fig.6 Trypsin inhibitor activity of different parts of gourd

由圖6可知，其中瓠瓜籽的抑制活性最高為29.8TIU/g，瓠瓜肉次之為28.3TIU/g，瓠瓜瓤最小為19.1TIU/g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗確定了瓠瓜胰蛋白酶抑制劑的最佳提取條件，即pH8、料液比1:4(m/V)、提取溫度70℃、提取時間1h；測定了瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制劑含量，瓠瓜籽為38.66μg/mL、瓠瓜肉為37.06μg/mL、瓠瓜瓤為25.33μg/mL；測定了瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制劑活性，瓠瓜籽為29.8TIU/g、瓠瓜肉為28.3TIU/g、瓠瓜瓤為19.1TIU/g。

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