微膠囊形成過(guò)程中酪蛋白與麥芽糊精相互作用研究

石 燕，劉 凡，鄭 燚，鄭為完,3，葛 輝

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與工程系，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué)計(jì)算機(jī)信息工程學(xué)院，江西 南昌 330027；3.江西維爾寶食品生物有限公司，江西 高安 330800)

微膠囊具有將液體粉末化、保護(hù)活性組分和控制芯材釋放等功能，其結(jié)構(gòu)形態(tài)特征，如顆粒的孔隙、表面完整性會(huì)影響微膠囊品質(zhì)，從而決定產(chǎn)品貨架期[1-3]。選擇合適的壁材是生產(chǎn)高穩(wěn)定性微膠囊的關(guān)鍵，油脂微膠囊的壁材成分主要有蛋白質(zhì)與多糖[4]。蛋白質(zhì)是表面活性劑，具有乳化劑的特征結(jié)構(gòu)；多糖則有良好的增稠性和持水性[5]。蛋白質(zhì)在微膠囊加工過(guò)程中與多糖共混，多糖的加入會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[6-7]，可能原因是蛋白質(zhì)和多糖之間發(fā)生了交互作用，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象產(chǎn)生了影響。

蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定其功能，傅里葉變換紅外光譜是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相互關(guān)系的有力手段，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其分子內(nèi)形成的氫鍵密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的紅外吸收光譜由9個(gè)酰胺吸收帶組成，其中酰胺Ⅰ帶(1700～1600cm-1)主要包含了C＝O的伸縮振動(dòng)，已廣泛應(yīng)用于二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的研究，但水汽在1640cm-1附近的吸收很強(qiáng)，對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性造成很大的影響[8]。蛋白質(zhì)的酰胺Ⅲ帶(1330～1220cm-1)由于信號(hào)較弱，過(guò)去很少用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，但由于H2O在此區(qū)間無(wú)吸收，解決了水汽干擾問(wèn)題，而且蛋白質(zhì)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅲ帶的光譜性質(zhì)特征明顯，擬合過(guò)程中易于將其分離，彌補(bǔ)了酰胺Ⅰ帶中α-螺旋結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲難以區(qū)分的缺點(diǎn)[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)擬利用傅里葉紅外光譜酰胺Ⅰ帶及酰胺Ⅲ帶研究麥芽糊精與酪蛋白相互作用情況，采用吸光度光譜差減法，結(jié)合去卷積、二階導(dǎo)數(shù)譜和曲線擬合等數(shù)學(xué)處理方式分析酪蛋白酰胺Ⅲ帶的譜圖變化，觀察酪蛋白與麥芽糊精在微膠囊壁形成過(guò)程中酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況，并比較酪蛋白與麥芽糊精相互作用后對(duì)其乳化穩(wěn)定性的影響，分析其產(chǎn)生原因，對(duì)微膠囊壁形成過(guò)程中麥芽糊精與酪蛋白相互作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白 美國(guó)Sigma公司；麥芽糊精(分析純) 上海青析化工科技有限公司；大豆油 中糧集團(tuán)；十二烷基硫酸鈉(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet Nexus FT-IR傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；SLS高壓均質(zhì)機(jī) 上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；壓力噴霧干燥機(jī) 錫山市干燥機(jī)廠；BT00-100M蠕動(dòng)泵常州科健蠕動(dòng)泵；721型分光光度計(jì) 上海第三儀器分析廠。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物制備

將酪蛋白與麥芽糊精以質(zhì)量比1:2.5進(jìn)行復(fù)配作為微膠囊壁材，經(jīng)80℃水浴溶解，40MPa高壓均質(zhì)后，進(jìn)風(fēng)溫度200℃、出風(fēng)溫度95～97℃、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速15.5r/min噴霧干燥法制備酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物。

1.3.2 譜圖收集

酪蛋白及其復(fù)合物在100℃烘箱中干燥2h。用KBr壓片法制樣，采用Nicolet Nexus FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀記錄干燥的蛋白質(zhì)、麥芽糊精及噴霧干燥后酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物的紅外光譜圖，波長(zhǎng)掃描范圍為500～4000cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32，收集樣品光譜。

1.3.3 譜圖處理

對(duì)添加麥芽糊精前后酪蛋白的紅外光譜變化進(jìn)行減差處理([酪蛋白+麥芽糊精]－麥芽糊精)去除麥芽糊精對(duì)譜圖的影響。利用OMNIC 7.3對(duì)酪蛋白的酰胺Ⅲ帶(1330～1220cm-1)進(jìn)行兩點(diǎn)基線校正，采用9點(diǎn)Savitzky-Golay平滑處理后，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二階求導(dǎo)和傅里葉去卷積(FSD)，從而估計(jì)各子峰的峰位和半峰寬，酪蛋白的FSD曲線參數(shù)選擇譜帶寬度8.48，增強(qiáng)因子3.0；酪蛋白-麥芽糊精的FSD曲線參數(shù)選擇譜帶寬度7.66，增強(qiáng)因子3.0，使二階導(dǎo)數(shù)曲線和FSD曲線中的各子峰的個(gè)數(shù)和峰位基本相同。通過(guò)Origin Pro 8.0軟件對(duì)酰胺Ⅲ帶進(jìn)行Gaussian曲線擬合，其殘差R2＞0.93。

1.3.4 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定[11-12]

分別稱(chēng)取酪蛋白和酪蛋白-麥芽糊精共價(jià)復(fù)合物5g，溶于300mL去離子水中，緩慢加入大豆油10mL，使用高速分散機(jī)在2000r/min條件下分散2min，制成乳狀液，立即從乳狀液底部吸收100μL乳濁液，迅速與0.1%十二烷基磺酸鈉溶液50mL混合，混勻后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定該稀釋液的吸光度A0，吸光度正比于乳濁液的液滴界面面積。因此，A0越大，蛋白質(zhì)的乳化活性越高。

以t時(shí)間間隔(t依次為0、10、20、30、40、50min)從乳狀液底部用微量注射器抽取樣品100μL，立即與0.1%十二烷基磺酸鈉溶液50mL混合，然后使用分光光度計(jì)于500nm波長(zhǎng)處讀取其吸光度At，乳化穩(wěn)定性(ES)由以下公式計(jì)算得出。

式中：A0為初始吸光度；At為tmin后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

通過(guò)對(duì)比酪蛋白(圖1)、麥芽糊精(圖2)以及經(jīng)加熱噴霧干燥酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物(圖3)的紅外光譜圖，圖1中3300.4cm-1處的吸收峰屬于酪蛋白中N—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，2962.8cm-1的吸收峰是飽和C—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，1654.2cm-1的吸收峰是酰胺Ⅰ帶中C＝O的伸縮振動(dòng)吸收，1448.7cm-1處為C—N伸縮振動(dòng)吸收，1240.9cm-1則是酰胺Ⅲ帶中N—H、C—N的無(wú)規(guī)則纏繞。圖2中3416.2cm-1處寬而強(qiáng)的譜帶是碳水化合物典型的締合O—H伸縮振動(dòng)吸收，2926.9cm-1為飽和C—H伸縮振動(dòng)，1648.2cm-1為烯烴的C＝C伸縮振動(dòng)，1426.1cm-1和1370.2cm-1是C—O—H中的O—H的彎曲振動(dòng)，1156.2～861.0cm-1處的吸收峰是屬于多糖中的C—O伸縮振動(dòng)與環(huán)的振動(dòng)，其中1022.7cm-1屬于C—O—C的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，具有強(qiáng)吸收，926.5cm-1處屬于C—O—C的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，吸收峰弱，861.0cm-1屬于環(huán)振動(dòng)。由圖3可知，當(dāng)酪蛋白與麥芽糊精混合并經(jīng)噴霧干燥后，其產(chǎn)物的紅外光譜既有蛋白的酰胺化合物的吸收帶特征峰，又具有碳水化合物的特征吸收峰，其中N—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰強(qiáng)度增大并向高波數(shù)移動(dòng)至3384.9cm-1處，這是由于新物質(zhì)共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)了新的N—H鍵，導(dǎo)致吸收峰強(qiáng)度增大，同時(shí)，N—H鍵變成＝N—H，鍵長(zhǎng)縮短，伸縮振動(dòng)波數(shù)也會(huì)增大[13]；添加麥芽糊精后，經(jīng)水浴溶解和噴霧干燥后，酪蛋白酰胺Ⅰ帶移至1650.9cm-1左右，與圖2中顯示酪蛋白酰胺Ⅰ帶1654.6cm-1相比向低波數(shù)方向位移了約4cm-1，且峰的振動(dòng)明顯減弱，這是由于蛋白質(zhì)中氨基酸與周?chē)橘|(zhì)之間形成分子間氫鍵，氫鍵可增加分子間的作用力，有利于分子鏈的密集，當(dāng)氫鍵作用較強(qiáng)時(shí)，C＝O的電子云密度降低，吸收帶移向低波數(shù)[14-15]，證實(shí)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的存在。

圖1 酪蛋白紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of casein

圖2 麥芽糊精紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of maltodextrin

圖3 酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of casein in presence of maltodextrin

反應(yīng)前后的酪蛋白和麥芽糊精各自的特征吸收峰沒(méi)有明顯位移現(xiàn)象，說(shuō)明反應(yīng)后蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生展開(kāi)，只是蛋白質(zhì)分子中共價(jià)結(jié)合了糖鏈來(lái)改善其功能特性。

2.2 酪蛋白酰胺Ⅲ帶的光譜分析

圖4 酪蛋白酰胺Ⅲ帶的紅外光譜(上)和高斯曲線擬合圖譜(下)Fig.4 FT-IR spectrum (upper) and Gaussian fitting curves (bottom) in the amide Ⅲ region of casein alone (a) and in presence of maltodextrin (b)

酰胺Ⅲ帶峰的歸屬如下[16]：1330～1290cm-1為α-螺旋、1290～1270cm-1為β-轉(zhuǎn)角、1270～1250cm-1為無(wú)規(guī)卷曲、1250～1220cm-1為β-折疊。根據(jù)擬合曲線(圖4)對(duì)酪蛋白的酰胺Ⅲ帶進(jìn)行譜帶指認(rèn)，由表1計(jì)算出與麥芽糊精相互作用后，酪蛋白的α-螺旋含量分別為5.96%和15.29%，β-折疊的含量從58.64%減少到33.12%，減少了25.52%，β-轉(zhuǎn)角含量從7.93%增加到10.83%，無(wú)規(guī)卷曲從27.47%增加至40.76%，增加了13.29%。大部分蛋白質(zhì)隨著溫度的升高，α-螺旋含量會(huì)減少，無(wú)規(guī)卷曲會(huì)增加。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導(dǎo)致規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的剛性，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其他相互作用，使分子表現(xiàn)出較大的柔性[17]。微膠囊壁在形成過(guò)程中要經(jīng)過(guò)加熱和高壓均質(zhì)處理，使得蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，但α-螺旋含量的增加可能說(shuō)明了蛋白質(zhì)和麥芽糊精發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成了氫鍵，C＝O…H—N氫鍵使蛋白質(zhì)形成α-螺旋。

表1 酪蛋白酰胺Ⅲ譜帶曲線擬合結(jié)果及譜帶指認(rèn)Table 1 Infrared band positions, band areas determined by Gaussian curve fitting and band assignments in the amide Ⅲ spectral region of sodium caseinate

2.3 麥芽糊精對(duì)酪蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，添加麥芽糊精后，酪蛋白的乳化活性有一定程度的增加。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性逐步下降，在50min時(shí)間內(nèi)，酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性均高于酪蛋白(圖6)，這可能是由于兩者結(jié)合后酪蛋白的α-螺旋含量增加的緣故，由于大部分α-螺旋結(jié)構(gòu)具有兩親性，一側(cè)被疏水側(cè)鏈占據(jù)，另一側(cè)被親水殘基占據(jù)，有利于蛋白質(zhì)在油-水界面膜上的快速吸附和定向[18]；另外，兩者結(jié)合后，無(wú)序結(jié)構(gòu)含量增加也導(dǎo)致蛋白質(zhì)柔性增加，而蛋白質(zhì)在界面的吸附與分子柔性有關(guān)，酪蛋白和麥芽糊精作用分子柔性增大，也有利于蛋白質(zhì)在界面上發(fā)生廣泛的構(gòu)象轉(zhuǎn)變[19]。

圖5 麥芽糊精對(duì)酪蛋白乳化活性的影響Fig.5 Effect of maltodextrin on the emulsifying activity of casein

圖6 麥芽糊精對(duì)酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of maltodextrin on the stability of casein emulsion

3 結(jié) 論

酪蛋白作為微膠囊的壁材與麥芽糊精混合后，經(jīng)高壓均質(zhì)和噴霧干燥后，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性都有了一定的提高。微膠囊壁形成過(guò)程中酪蛋白紅外光譜測(cè)定結(jié)果表明酰胺Ⅰ帶發(fā)生了紫移，酪蛋白中氨基酸與周?chē)橘|(zhì)之間形成分子間氫鍵，證實(shí)有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的存在。通過(guò)擬合曲線對(duì)酪蛋白的酰胺Ⅲ帶進(jìn)行譜帶指認(rèn)結(jié)果表明：酪蛋白與麥芽糊精作用后，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，其中：α-螺旋含量增加了9.33%，β-折疊含量減少了25.52%，β-轉(zhuǎn)角含量增加2.90%，無(wú)規(guī)卷曲含量增加了13.29%。無(wú)序結(jié)構(gòu)從35.40%增加到51.59%，增加了16.19%，進(jìn)一步證明蛋白質(zhì)和麥芽糊精發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成了氫鍵。結(jié)合酪蛋白的柔性增加，麥芽糊精的加入對(duì)維持蛋白質(zhì)α-螺旋是有益的，α-螺旋的增加和無(wú)序結(jié)構(gòu)含量的增加可能是造成酪蛋白-麥芽糊精復(fù)合物乳化性和乳化穩(wěn)定性提高的因素。

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