海帶多糖硫酸酯對(duì)bFGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

劉 敏，彭臻菲，方哲翔，張其清,*，許小平

(1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建 福州 350002；2.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 福州 350002)

心腦血管疾病是中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。研究表明早期AS的形成是以血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖并遷移至內(nèi)膜下吞噬脂質(zhì)作為病變基礎(chǔ)[1]，因此抑制VSMC過(guò)度增殖對(duì)防治AS具有重要意義。

海帶在我國(guó)有悠久的食用歷史，是天然的保健食品，具有提高免疫力、預(yù)防心腦血管疾病等功效[2-3]。近些年來(lái)研究表明，海帶的藥用價(jià)值與其多糖成分密切相關(guān)[4]。海帶中提取的多糖具有抗氧化、抗凝血、降血脂等多種生物活性[5-8]，但目前對(duì)其抗AS的機(jī)制探討較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)建立VSMC增殖模型，研究海帶多糖硫酸酯對(duì)VSMC增殖的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，購(gòu)自福建省福州市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為L(zhǎng)aminaria japonica；DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS) 生工生物工程(上海)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國(guó)Biosharp公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 加拿大Bio Basic 公司；兔抗α-Actin多克隆抗體北京博奧森生物技術(shù)有限公司；超敏即用型二步法檢測(cè)試劑盒 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase) 瑞士Roche公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 海帶多糖硫酸酯的制備

[5,9-11]的方法，制備海帶多糖硫酸酯。具體步驟為：粉碎海帶后取干粉80g，加入1.6L無(wú)水乙醇脫脂，60℃水浴3h，不斷攪拌；過(guò)濾，烘干濾渣，稱(chēng)取60g，加入3L蒸餾水，沸水浴提取2次，每次3h；合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2L；緩慢加入500mL無(wú)水乙醇和5g CaCl2，靜置12h除去褐藻酸；過(guò)濾，加入無(wú)水乙醇，使其終體積分?jǐn)?shù)為75%，靜置6h；過(guò)濾，沉淀用蒸餾水溶解，真空冷凍干燥，即得海帶多糖硫酸酯WPS。WPS過(guò)DEAE A-25凝膠柱，依次用含0.6、1、2mol/L NaCl的pH7.4的Tris-HCl緩沖液洗脫，部分收集器收集洗脫液，苯酚-硫酸法[12]檢測(cè)各管多糖含量。以吸光度為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)，得到多糖洗脫曲線(xiàn)。依照洗脫曲線(xiàn)分別合并多糖濃度較高的洗脫部分，得到WPS-1、WPS-2和WPS-3共3個(gè)多糖硫酸酯組分。多糖各組分經(jīng)酸水解后，依據(jù)明膠-氯化鋇法[13]測(cè)定其硫酸根含量。

1.3 抑制VSMC增殖實(shí)驗(yàn)

1.3.1 VSMC培養(yǎng)

取120～180g 雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈，置于盛有無(wú)菌DMEM的平皿中，刮除內(nèi)膜面，剝?nèi)≈心愚D(zhuǎn)移到盛有胎牛血清的平皿中，剪切成1mm3左右的組織塊，貼至培養(yǎng)瓶底部，間距不超過(guò)0.5cm，加入3～4mL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。5d后可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)莱觯?xì)胞鋪滿(mǎn)底部即用0.25%的胰酶消化傳代。3代后進(jìn)行細(xì)胞鑒定，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用4～8代細(xì)胞。

1.3.2 VSMC鑒定

VSMC固定后，用山羊血清封閉，再加入稀釋的兔抗α-Actin多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜后用0.01mol/L PBS清洗，按北京中杉金橋技術(shù)有限公司超敏即用型二步法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，DAB顯色。對(duì)照組用0.01mol/L PBS代替兔抗α-Actin多克隆抗體。

1.3.3 MTT法檢測(cè)海帶多糖硫酸酯抑制bFGF誘導(dǎo)的VSMC增殖

參照文獻(xiàn)[14]的方法，將細(xì)胞配成2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，加入96孔板中(0.2mL/孔)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，饑餓處理過(guò)夜。加入不同濃度海帶多糖硫酸酯(100μL/孔)作用24h后，加入bFGF繼續(xù)培養(yǎng)。48h后將孔中培養(yǎng)液吸出，加入MTT(100μg/孔)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，578nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

各組依次加入75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)1mL、樣品0.2mL(對(duì)照組用蒸餾水代替)、0.1mol/L鹽酸羥胺溶液0.1mL、75mmol/L黃嘌呤溶液0.1mL和0.037U/mL黃嘌呤氧化酶溶液0.1mL，混勻后37℃孵育30min。再加入2mL顯色劑(0.4g/L甲萘胺+4g/L對(duì)氨基苯磺酸)，混勻后靜置5min，波長(zhǎng)530nm處測(cè)吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用±s表示，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VSMC培養(yǎng)

圖1 原代主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(×100)Fig.1 Primary culture of vascular smooth muscle cells (×100)

由圖1可見(jiàn)，培養(yǎng)5d后可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)莱?A)，且呈梭狀貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)至12d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞呈束狀向外延伸生長(zhǎng)(B)，至21d呈現(xiàn)“峰-谷”狀生長(zhǎng)形態(tài)(C)。

2.2 VSMC鑒定

由圖2可見(jiàn)，免疫組化法鑒定平滑肌α-Actin，倒置顯微鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)棕黃色絲狀α肌動(dòng)蛋白，證實(shí)為VSMC。

圖2 免疫組化法鑒定VSMC(×250)Fig.2 Identification of VSMCs by immunohistochemistry (×250)

2.3 海帶多糖硫酸酯對(duì)VSMC增殖作用的影響

圖3 WPS、WPS-1、WPS-2和WPS-3對(duì)bFGF誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響Fig.3 Effects of WPS, WPS-1, WPS-2 and WPS-3 on bFGF-induced proliferation of VSMC

通過(guò)MTT法測(cè)定OD值可反映細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，即OD578nm越高增殖活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同海帶多糖硫酸酯組分對(duì)bFGF誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響進(jìn)行研究。由圖3可知，加入bFGF誘導(dǎo)后，模型組VSMC增殖極顯著(P≤0.01)，說(shuō)明bFGF增殖模型成功建立。在海帶多糖硫酸酯干預(yù)下bFGF誘導(dǎo)的VSMC增殖受到抑制，其中WPS對(duì)VSMC的增殖抑制作用最為顯著。當(dāng)WPS質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時(shí)測(cè)得細(xì)胞OD578nm下降至0.244，比模型組降低了0.026。質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，WPS對(duì)VSMC的增殖達(dá)到最大抑制作用，此時(shí)細(xì)胞OD578nm已降至0.185，抑制率為31.5%。WPS-1和WPS-3對(duì)VSMC的增殖均表現(xiàn)出一定的抑制作用，表現(xiàn)在各多糖干預(yù)組VSMC的OD值均比模型組低，尤其在高質(zhì)量濃度(1mg/mL)條件下抑制作用更為明顯，抑制率均在20%左右。與之相比，WPS-2對(duì)VSMC的抑制作用則不顯著，在0.1～1mg/mL質(zhì)量濃度條件下，抑制率均在10%以?xún)?nèi)。

表1 1 mg/mL時(shí)各樣品組分對(duì)·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

表1 1 mg/mL時(shí)各樣品組分對(duì)·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

樣品 WPS WPS-1 WPS-2 WPS-3清除率/% 75.68± 0.45 73.04± 0.65 34.05± 3.08 90.16± 0.93

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從大鼠胸主動(dòng)脈中取得VSMC，并通過(guò)bFGF誘導(dǎo)建立VSMC增殖模型，用于觀察海帶多糖硫酸酯對(duì)VSMC異常增殖的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同組分海帶多糖硫酸酯對(duì)VSMC的增殖抑制活性各不相同。其中，WPS對(duì)VSMC的增殖抑制作用最強(qiáng)，WPS-1和WPS-3次之，而WPS-2對(duì)VSMC的增殖基本無(wú)影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖硫酸酯對(duì)·清除效應(yīng)與其抑制VSMC增殖作用基本一致，表現(xiàn)為WPS、WPS-1和WPS-3具有顯著的·清除力，而WPS-2對(duì)·清除力較弱。已有研究報(bào)道，bFGF刺激VSMC增殖的機(jī)制與增加細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度有關(guān)，胞內(nèi)H2O2濃度的增加會(huì)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而促使VSMC 增殖[16]。對(duì)抗氧化劑Probucol抑制VSMC增殖的研究也表明，Probucol能增強(qiáng)超氧化物歧化酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度，從而抑制MAPK信號(hào)通路對(duì)VSMC增殖的調(diào)控[17-18]。由此推測(cè)，海帶多糖硫酸酯對(duì)VSMC異常增殖的抑制機(jī)制與其抗氧化活性密切相關(guān)，很可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)，進(jìn)而改變對(duì)氧化還原敏感的增殖性和抑制性信號(hào)蛋白酶和轉(zhuǎn)錄因子活性之間的平衡，抑制了VSMC增殖。下一步，我們將繼續(xù)探討海帶多糖硫酸酯抑制VSMC增殖機(jī)制，為海帶多糖在早期AS防治中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]ROSS R.The pathogenesis of atherosclerosisan: an update[J].The New England Journal of Medicine, 1986, 314: 488-500.

[2]王文亮, 王守經(jīng), 宋康, 等.海帶的功能及其開(kāi)發(fā)利用研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2008(8): 26-27.

[3]葉盛英, 李宏.海帶藥用研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué), 2003, 15(6): 58-61.

[4]張洪建, 楊琳, 李勁平.海帶多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床, 2009, 24(4): 217-219.

[5]ZHAO Xue, XUE Changhu, LI Bafang.Study of antioxidant activities of sulfated polysaccharides fromLaminaria japonica[J].J Appl Phycol, 2008, 20: 431-436.

[6]李哲, 羅靜海, 杜曉俊, 等.海帶褐藻多糖提取方法改進(jìn)及抗凝血探究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4): 297-298.

[7]王庭欣, 王庭祥, 龐佳宏.海帶多糖降血糖、血脂作用的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2007, 29(1): 99-100.

[8]廖建民, 沈子龍, 張瑾.海帶多糖中不同組分降血脂及抗腫瘤作用的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 33(1): 55-57.

[9]郭亞貞, 王慥.海帶中褐藻糖膠的提取與純化[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 9(3): 276-279.

[10]門(mén)曉媛, 王一飛, 康琰琰, 等.裙帶菜硫酸多糖的制備及其性質(zhì)研究[J].食品科學(xué), 2006, 27(3): 156-161.

[11]劉海光.海帶多糖的分離純化及活性研究[D].濟(jì)南: 山東大學(xué),2007.

[12]DUBOIS M, GILLIS K A, HAMILTON J K, et al.Colorimetric method for determination of sugarsand related substances[J].Anal Chem, 1956, 28: 350-356.

[13]張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社,1987: 296-297.

[14]OKA M, MAEDA S, KOGA N, et al.A modified colorimetric MTT assay adapted for primary cultured hepatocytes: application to proliferation and cytotoxicity assays[J].Biosci Biotech Biochem,1982, 56: 1472-1473.

[15]MITSUHIRO Y.Oxidant stress and atherosclerosis[J].Current Opinion in Pharmacology, 2004, 4: 110-115.

[16]季寧東.血管平滑肌細(xì)胞的增殖機(jī)制[J].中國(guó)基層醫(yī)藥, 2002, 9(3):270-271.

[17]MANTHA SV, KALRA J, PMSAD K.Effects of probucol on hyperebelestexolemia-induced changes in antioxidant enzymes[J].Life Sci, 1996, 58(6): 503-509.

[18]盛林, 潘其興, 劉亞軍, 等.Probucol對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和過(guò)氧化氫促大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J].中國(guó)病理生理雜志, 2001, 17(6): 515-518.