鮰愛德華菌hcp基因的克隆及重組表達

魏暢，李華，葉仕根，李強

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023）

鮰愛德華菌hcp基因的克隆及重組表達

魏暢，李華，葉仕根，李強

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023）

通過克隆獲得鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluriLH51溶血素共調節(jié)蛋白 (Hcp）編碼基因hcp，該基因全長為489 bp，編碼163個氨基酸，hcp編碼蛋白的理論相對分子質量為17 800，等電點為5.21。氨基酸序列分析結果表明，鮰愛德華菌hcp基因與遲鈍愛德華菌Edwardsiella tarda毒力蛋白EvpC(Hcp同源物）、發(fā)光桿菌Photorhabdus luminescens hcp基因等具有高度同源性。將鮰愛德華菌Hcp氨基酸序列連接至pGS-21a表達載體中，成功構建了pGS-21 a-hcp原核表達質粒;再將表達質粒轉化至BL21(DE3）菌株后，經(jīng)IPTG誘導、鎳柱層析純化獲得大量攜帶GST和組氨酸雙標簽的融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，確認獲得了相對分子質量約為45 000的融合蛋白，并成功制備了具有較高效價的多克隆抗體。

鮰愛德華菌;hcp基因;基因克隆;原核表達

細菌的分泌系統(tǒng)能夠將蛋白質釋放到胞外或直接運輸?shù)剿拗骷毎?，參與細菌與細菌之間或細菌與宿主之間的相互作用。這種細胞間的相互作用在細菌的生存以及對宿主生物致病的過程中起著重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)至少有7種類型的細菌分泌系統(tǒng) (T1SS～T7SS），它們各自擁有不同的結構特征和作用機制。Ⅵ型分泌系統(tǒng) (T6SS）是由Pukatzki等［1］在霍亂弧菌Vibrio cholerae中首先證實并命名的。目前，在約25%已測序的革蘭氏陰性細菌中發(fā)現(xiàn)了編碼T6SS的基因［2］。自發(fā)現(xiàn)T6SS在霍亂弧菌感染宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用以來，有關T6SS與細菌毒力關系的報道較多［3-6］。研究表明，細菌T6SS不僅與細菌的毒力密切相關，還參與了細菌的群體感應信號調節(jié)，對于細菌在惡劣條件下的存活和在真核宿主細胞中的繁殖均具有重要意義。

細菌T6SS通常由15到25個蛋白組成，包括結構蛋白、調控蛋白、效應蛋白和伴侶蛋白等［7］。溶血素共調節(jié)蛋白 (hemolysin coregulated protein，Hcp）最早發(fā)現(xiàn)于霍亂弧菌［8］，并在銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa中被再次確認［9］。Hcp 是T6SS中高度保守的組分，存在于所有具有T6SS的細菌中。Hcp與T4噬菌體尾管蛋白gp19同源，可以在體外形成六聚環(huán)結構，是細菌T6SS輸送裝置的主要組成部分。此外，Hcp還可作為效應蛋白與VgrG一起被輸送到胞外而發(fā)揮作用［1，10］，如銅綠假單胞菌Hcp1蛋白就是由毒力相關基因座 (HSI-I）編碼的蛋白分泌裝置分泌到細胞外的［9］。Williams等［8］發(fā)現(xiàn)，小調節(jié)蛋白HlyU編碼基因的導入 (或插入失活）可同時顯著促進 (或抑制）霍亂弧菌Hcp和溶血素HlyA的表達，而hcp1和hcp2基因雙缺陷可明顯減弱霍亂弧菌O37血清型菌株的毒力。此外，霍亂弧菌群體感應系統(tǒng)中的效應調節(jié)子LuxO可負向調控Hcp的表達，表明Hcp參與了細菌的群體感應調節(jié)［11］。同樣，遲鈍愛德華菌Edwardsiella tarda毒力相關蛋白EvpC(Hcp同源物）的基因缺失突變可導致細菌毒力顯著降低［5］。盡管已有許多報道證實，Hcp與細菌毒力及群體感應調節(jié)關系密切，但Hcp的具體生物學功能目前尚不清楚，其在T6SS中如何行使其生物學功能以及在細菌致病中的具體作用機制已成為近年來的研究熱點之一。

鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluri為腸桿菌科、愛德華氏菌屬的革蘭氏陰性短桿狀細菌［12］。它是重要的水生動物病原，可感染斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus患腸型敗血癥，對斑點叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)危害最大。近年來，中國遼寧、湖北、四川、廣東等地養(yǎng)殖的黃顙魚頻發(fā)的“紅頭病”，也是由鮰愛德華菌感染所致［13］。有關鮰愛德華菌的致病機理是水產(chǎn)工作者關注的重點之一。Williams等［14］進行了鮰愛德華菌全基因組測序分析，結果表明，鮰愛德華菌擁有完整的T6SS編碼基因。鮰愛德華菌T6SS編碼蛋白及其生物學功能和作用機制目前尚不清楚。本研究中，通過克隆Hcp編碼基因，獲得了重組表達蛋白，并成功制備了具有高效價的多抗，為進一步研究鮰愛德華菌Hcp的生物學功能及其在T6SS中的作用機制奠定了基礎，可為探尋鮰愛德華菌病的防控方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮰愛德華菌LH51取自大連海洋大學病害實驗室。大腸桿菌DH5 α、BL21(DE3）感受態(tài)細胞，以及質粒小提試劑盒、His-Tag單克隆抗體等均購自天根生物科技有限公司;限制性內切酶XhoI、BamHI和T4 DNA連接酶購自Fermenters公司;克隆載體pMD18-T和表達載體pGS-21a分別購自大連寶生物公司和金思特 (南京）科技有限公司;氨芐青霉素 (Amp）和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG）購自上海生工生物工程技術服務有限公司;His-Bind Purification Kit購自德國Novagen公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 依據(jù)GenBank中公布的鮰愛德華菌(GeneBank登錄號:YP_002934142.2）全基因組序列設計hcp克隆引物并于5'端分別引入酶切位點。引物序列為

其中下劃線處分別為引入的BamHI和XhoI酶切位點，擴增目標序列。

以鮰愛德華菌LH51菌液為模板進行PCR擴增。PCR擴增反應體系共25 μL，包括模板1 μL，Taq 酶 0.125 μL，10 × PCR Buffer(Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP 2 μL，引物 hcp-F/R 各0.5 μL，以滅菌雙蒸水補足25 μL。反應條件:94℃下預變性5 min;94℃下變性30 s，52℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸5 min。反應結束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將PCR產(chǎn)物與載體pMD-18T于16℃下連接30 min后，轉化至DH5 α感受態(tài)細胞中，在37℃下培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆送華大基因生物有限公司測序。

1.2.2 生物信息學分析 采用 Blast在線工具(http//www.ncbi.nlm.gov/blast）和 Clustal X 1.8軟件進行序列比對和同源性分析;采用Mega 3.1軟件構建進化樹;在Interproscan網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan）和 EXPASY 網(wǎng)站 (http://web.expasy.org/protparam）在線進行編碼蛋白的功能域預測和理化性質分析。

1.2.3 表達菌株的構建及鑒定 參照孫志鵬等［15］原核表達方法。提取重組質粒pMD18T-hcp和表達載體pGS-21a并進行BamHI、XhoI雙酶切。目的片段經(jīng)切膠回收后，在22℃條件下用T4連接酶連接1.5 h。連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞DH5 α中，在37℃下培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆 (含pGS-21a-hcp）送華大基因生物有限公司測序。

將測序正確的質粒pGS-21a-hcp轉入大腸桿菌BL21(ED3）感受態(tài)細胞中。涂布于含氨芐青霉素 (Amp，100 μg/mL）LB瓊脂平板上，次日挑選單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基 (Amp，100 μg/mL）中，37℃下震蕩培養(yǎng)12 h，提取質粒pGS-21a-hcp并進行XhoI和BamHI雙酶切鑒定。1.2.4 誘導表達及Western blot分析 將表達菌株BL21(pGS-21a-hcp）接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 OD600nm值為 0.5后，加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG誘導6 h，以12 000 r/min離心1 min，收集菌體，進行SDS-PAGE分析。

參照王忠等［16］、李強等［17］的方法，稍加改動，進行免疫印跡分析。將表達產(chǎn)物進行SDSPAGE后，電轉移至硝酸纖維素 (NC）膜上。用質量分數(shù)為3%的牛血清白蛋白在4℃下封閉過夜，用PBST洗滌3次，每次5 min;置于抗GST單抗中 (用0.01 mol/L PBS稀釋至終濃度為0.1 μg/mL），37℃下孵育1 h，再用PBST洗滌3次，每次5 min。將NC膜置于堿性磷酸酶 (AP）標記的羊抗鼠 IgG抗體中 (用0.01 mol/L PBS按1∶3 000稀釋），37℃下孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次后，加入NBT/BCIP底物緩沖溶液顯色5 min，觀察結果。

1.2.5 蛋白純化、多克隆抗體的制備、誘導表達和Western blot分析 將經(jīng)誘導表達的菌株進行超聲破碎，離心，收集上清。將培養(yǎng)的上清經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，采用His-Bind Purification Kit進行可溶性蛋白的洗脫純化并分段收集洗脫液進行SDS-PAGE分析。純化后的重組蛋白經(jīng)定量后加入0.5 mmol/L PMSF，于-20℃下保存。

取100 μL重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合、乳化后，取100 μL以腹腔注射方式免疫小鼠(共2只）;兩周后，取同樣劑量的純化蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合、乳化，進行加強免疫;再一周后進行二次加強免疫。7 d后，從小鼠眼眶取血，收集血清，按每管50 μL分裝，放入冰箱(-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Dot-ELISA方法測定多克隆抗體效價。確定多抗最高效價后，以該抗體為一抗，以AP標記的羊抗鼠IgG為二抗，用Western blot檢測蛋白hcp，以確定多抗特異性。

1.2.6 鮰愛德華菌Hcp表達的檢測 將鮰愛德華菌接種于營養(yǎng)肉湯 (NB）培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)。分別取 OD600nm為 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40的菌液1 mL，離心，分離菌體和培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)的上清于-20℃下保存?zhèn)溆谩＞w用1 mL滅菌的PBS重懸后超聲破碎，離心，取上清于-20℃下保存。以上述培養(yǎng)的上清和菌體裂解產(chǎn)物為抗原，以抗Hcp多克隆抗體為一抗，用Western blot檢測該蛋白在鮰愛德華菌中的表達和泌出情況。

2 結果

2.1 hcp基因的克隆

F/R進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在約490 bp處出現(xiàn)特異性條帶 (圖1），與預期結果一致。

圖1 hcp基因的RT－PCR擴增Fig.1 The RT－PCR amplification of hcp gene

2.2 hcp基因的生物信息學分析

2.2.1 hcp及其編碼氨基酸的序列結構分析 hcp基因全長為489 bp，編碼163個氨基酸，其核苷酸序列和編碼氨基酸序列見圖2。hcp編碼蛋白(GeneBank登錄號:JX17440）的相對分子質量為17 800，等電點為 5.21，蛋白脂溶指數(shù)為 61.72，為疏水性蛋白;編碼蛋白的穩(wěn)定性指數(shù)為26.54，屬穩(wěn)定性蛋白。應用Interproscan工具 (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan）對 Hcp 功能進行預測，結果顯示，該蛋白與已報道的多種細菌Hcp結構功能相似，均屬于T6SS的一種毒力因子，同時也作為分泌裝置發(fā)揮作用。

圖2 hcp核苷酸序列與氨基酸序列分析Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence analysis of hcp

2.2.2 Hcp氨基酸序列的同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析 Blsatx結果顯示，Hcp氨基酸序列與已報道的T6SS相關基因序列有較高的一致性。選取部分GenBank中已經(jīng)報道的T6SS相關基因序列，用Clustal X 1.8軟件對氨基酸序列同源性進行比較分析，結果表明，該蛋白的氨基酸序列保守性較高，與遲鈍愛德華T6SS的EvpC序列相似度為100%，一致性高達91%(表1、圖3）。根據(jù)Hcp氨基酸序列相似性和同源性對比結果，構建Neighborhood-Joining進化樹 (圖4），結果顯示，其與遲鈍愛德華菌聚為一支，說明二者親緣關系最近。

2.3 表達菌株BL21(pGS－21a－h(huán)cp）的構建

克隆載體經(jīng)雙酶切后回收目的片度hcp并與表達質粒pGS-21a連接，轉入菌株BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)測序驗證正確。提取質粒pGS-21a-hcp進行雙酶切鑒定，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約490 bp處出現(xiàn)目的條帶 (圖5），證明表達菌株構建成功。

表1 用于構建進化樹的氨基酸序列與鮰愛德華菌Hcp氨基酸序列的相似度Tab.1 Amino acid sequences for construction of phylogenetic tree and the similarity with Hcp %

注:用陰影表示保守氨基酸，黑色、灰色和淺灰色分別表示保守性為100%、［75%～100%）和［50%～75%）的氨基酸。Note:Conserved amino acids are highligthed with shade，black，grey and light-grey shades represent the amino acids conservation of 100%，［75% ～100%），and［50% ～75%），respectively.

2.4 重組蛋白的表達與Western blot分析

表達菌株BL21(pGS-21a-hcp）經(jīng)IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE分析，以未誘導的表達菌株BL21為陰性對照，以含有空載體pGS-21a的BL21誘導菌株為陽性對照。結果顯示，在相對分子質量為45 000處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶 (圖6-A），與預期大小一致。以Anti-His標簽抗體為一抗，以堿性磷酸酶 (AP）標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blot分析，成功檢測到該融合蛋白 (圖6-B），進一步證明了該蛋白已成功表達。

圖4 Edwardsiella ictaluri Hcp系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree of Edwardsiella ictaluri Hcp

2.5 蛋白的純化及多克隆抗體的制備

經(jīng)SDS-PAGE分析，親和純化產(chǎn)物在相對分子質量約45 000處出現(xiàn)一條蛋白條帶 (圖6-C），可明顯觀察到，收集的二號管樣品蛋白含量最大。采用Dot-ELISA方法測定多克隆抗體效價 (圖6-D），當抗體稀釋163 840倍時，仍可觀察到陽性反應 (圖6編號15）;當抗體稀釋327 680倍時，未出現(xiàn)陽性信號反應(圖6-D編號16），據(jù)此可判制備的多克隆抗體效價為1∶163 840。以該多抗為一抗，以AP標記的羊抗鼠IgG為二抗，用Western blot檢測Hcp，在相對分子質量約45 000處出現(xiàn)特異性條帶，這表明制備的多抗可特異性地識別該蛋白 (圖6-B）。應用制備的多抗，未能檢測到泌出的鮰愛德華菌Hcp(圖略）。

圖5 重組質粒pGS－21a－h(huán)cp的雙酶切Fig.5 Identification of recombination plasmid pGS－21a－h(huán)cp by enzyme digestion

圖6 蛋白純化及多抗制備結果Fig.6 Results of protein purification and antibody preparation

3 討論

作為T6SS的重要組成成員，Hcp是由 Williams等［8］在研究霍亂弧菌毒力基因表達調節(jié)時首先發(fā)現(xiàn)并命名的?，F(xiàn)有研究表明，Hcp與細菌毒力及群體感應調節(jié)密切相關，在細菌存活及致病中發(fā)揮重要作用［1，5，8，11，18］。事實上，Hcp 是 T6SS 中高度保守的組分，含有T6SS的細菌只要條件適宜都會分泌Hcp，該蛋白已被作為確認T6SS的可靠指標［19］。Williams等［14］于 2012 年對鮰愛德華菌全基因組測序的結果表明，鮰愛德華菌擁有完整的T6SS的編碼基因，但至今未見鮰愛德華菌hcp基因及其相關功能的研究報道。本研究中通過設計特異性引物，以鮰愛德華菌LH51為模板成功克隆到全長為489 bp、編碼163個氨基酸的一個基因。對其氨基酸序列分析表明，該編碼蛋白的理論相對分子質量為17 800，等電點為5.21。

對鮰愛德華菌Hcp氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白的氨基酸序列與遲鈍愛德華菌EvpC(Hcp同源物）氨基酸序列的一致性高達91%，與大腸桿菌、腸炎沙門菌的Hcp1氨基酸序列的一致性也均在30%以上。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，鮰愛德華菌Hcp氨基酸序列與遲鈍愛德華菌EvpC聚為一支，同為細菌Hcp的同源物。通過序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究中獲得了鮰愛德華菌Hcp的編碼基因，命名為hcp(GenBank登錄號為JX174409）。研究結果確認了鮰愛德華菌LH51擁有Hcp編碼基因，這與Williams等［14］對鮰愛德華菌93～146的全基因組測序結果一致。同時，研究結果也證實了Hcp在T6SS中的保守性及其作為T6SS確認指標的可靠性。

在T6SS被證實不久，人們就發(fā)現(xiàn)其部分組分如Hcp與VgrG具有與噬菌體蛋白相似的二級結構［20］。隨后的X-射線分析結果證實，銅綠假單胞菌和遲鈍愛德華菌的Hcp同源物可通過“頭—頭”或“頭—尾”相連的方式形成六聚環(huán)狀結構，這與λ噬菌體gpV蛋白形成噬菌體尾管結構十分相似［9，21-22］。Hcp 再與 VgrG 形成的尾釘樣結構(與T4噬菌體gp27/gp5復合物類似）組裝在一起，并被TssB/TssC亞基形成的鞘狀結構包裹起來形成噬菌體樣結構［23-24］。更多的研究表明，與遲鈍愛德華菌毒力相關的蛋白EvpC編碼基因 (Hcp同源基因）的缺失，可阻礙EvpP向細菌培養(yǎng)上清中分泌［5］。由此推測，Hcp作為T6SS的裝置蛋白參與了 T6SS蛋白泌出通道的形成。T6SS通過TssB/TssC作用于Hcp，從而將目的蛋白輸送到胞外或直接注入宿主細胞內。功能預測分析顯示，hcp編碼蛋白與其他細菌的Hcp同源物一樣能形成六聚環(huán)狀結構，可能擁有與其他Hcp同源物相同或相似的功能，參與鮰愛德華菌T6SS裝置蛋白的形成。

為進一步研究鮰愛德華菌Hcp的生物學功能及其在T6SS中具體作用機制，本研究中克隆到鮰愛德華菌Hcp編碼基因hcp，并在對其進行生物信息學分析的基礎上，進行了鮰愛德華菌Hcp蛋白的重組表達，經(jīng)純化獲得了較高純度的融合蛋白并制備了高效價的多克隆抗體。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，獲得的融合蛋白相對分子質量約為45 000，與預期大小基本一致。該研究結果與Williams等［8］1996年在霍亂弧菌Hcp重組表達結果和Rao等［25］對遲鈍愛德華菌的研究結果一致。Ishikawa等［26］利用制備的多克隆抗體檢測霍亂弧菌Hcp的表達情況，結果顯示，不同培養(yǎng)時期細菌Hcp的表達情況有明顯區(qū)別。同樣，本研究中利用制備的多克隆抗體檢測了鮰愛德華菌Hcp的表達情況，但結果未能檢測到目的條帶。這可能是由于在本研究條件下，鮰愛德華菌Hcp不表達或表達量過低造成的，其具體調節(jié)機制和影響因素仍需要進一步深入研究。該研究結果可為進一步研究鮰愛德華菌Hcp的生物學功能，深入探討T6SS在鮰愛德華菌致病中的作用機制，尋找有效的防控方法奠定基礎。

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Cloning and recombinant expression of pathogenic bacterium Edwardsiella ictaluri hcp gene

WEI Chang，LI Hua，YE Shi-gen，LI Qiang
(Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The hcp gene encoding hemolysin coregulated protein was sequenced from pathogenic bacteriumEdwardsiella ictaluriLH51 by cloning.It was found that the hcp gene contained the opening reading frame of 489 bp in length，encoding 163 amino acids with molecular weight of 17 800，and theoretical isoelectric point of 5.21.Multiple sequence alignment indicated that theE.ictaluri hcpshared high homology with those from pathogenic bacteriaEdwardsiella tarda and Photorhabdus luminescens.A recombinant plasmid pGS-21a-hcp containing the coding sequence of hcp gene was constructed using pGS-21a as a fused expression vector.The SDS-PAGE and Western blot revealed that the recombined protein was expressed successfully in Escherichia coli BL21(ED3）induced by IPTG.Then a recombinant fusion protein about 45 000 was purified by Ni2+-NTA His-bind column chromatography，and the polyclonal antibody was prepared.

Edwardsiella ictaluri;hcp gene;gene cloning;prokaryotic expression

S943

A

2095-1388(2013）05-0424-07

2013-09-01

國家“十二五”科技支撐計劃項目 (2011BAD13B03）

魏暢 (1988-），女，碩士研究生。E-mail:841949267@qq.com

李華 (1958-），女，博士，教授。E-mail:lihua@dlou.edu.cn