果蠅Mef2基因多克隆抗體的制備及檢測

朱玲 徐臘梅 盛立翔 吳秀山

摘要為了在果蠅模型中進(jìn)一步研究Mef2基因的功能，制備了Mef2多克隆抗體．以果蠅cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增出親水性和特異性均好的果蠅Mef2基因片段，將其克隆入pET28a原核表達(dá)載體，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株Rossetea，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白．融合蛋白先經(jīng)NiIDA凝膠柱純化，再免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，然后用不同濃度的抗體分別進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測抗體效價．所得結(jié)果顯示獲得了較高效價的果蠅Mef2多克隆抗體．

關(guān)鍵詞Mef2；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號R39211 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號10002537（2012）05006404

Mef2屬于MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因，MADS家族是指其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子的總稱［1］．MADS結(jié)構(gòu)域是一種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由55～63個氨基酸組成，所識別并結(jié)合的DNA保守序列為CArG框［CC（A/T）6GG］．

Mef2位于果蠅2號染色體上，mRNA全長5990bp，編碼501個氨基酸．脊椎動物有4種MEF2蛋白（MEF2AD），而果蠅中只有1種MEF2蛋白（DMEF2）［2］．不管是脊椎動物還是果蠅中的MEF2蛋白都含有一個高度保守的MADS和MEF2結(jié)構(gòu)域，并且由它們來介導(dǎo)DNA結(jié)合、二聚作用、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用［3］．

Mef2最初是在分化的肌肉細(xì)胞中作為一個肌肉特異結(jié)合的活性因子被鑒定的，1997年卻發(fā)現(xiàn)Mef2基因在心臟發(fā)育的過程中起重要作用［4］．在果蠅中，Mef2首先在原腸胚形成時在整個中胚層中表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育，它的表達(dá)逐漸限制在體節(jié)、內(nèi)臟和心肌細(xì)胞中［56］．鑒于Mef2基因在果蠅心臟發(fā)育的過程中起著重要的作用［7］，所以制備一個特異性好的多克隆抗體尤其重要，對進(jìn)一步以果蠅為模型研究Mef2基因具有重要的意義．

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

大腸桿菌Rosseta菌種，pET28a菌種以及coliDH5α菌種為本實(shí)驗(yàn)室提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，DNA、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker，TagDNA聚合酶購自深圳晶美公司；pMD18T載體和連接酶購自大連TaKaRa公司；UNIQ10柱式DNA膠回收純化試劑盒購自上海生工公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；GlutathioneSepharoseTM4B蛋白純化試劑盒購自PIERCE公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、IPTG（異丙基βD硫代半乳糖苷）等購自上海Sangon公司；新西蘭大白兔購自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部．

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索出果蠅Mef2基因的序列，根據(jù)巢式PCR的原理利用PrimerPremier5．0軟件設(shè)計(jì)兩對引物：第一對：DMef2S1：5′CGCCAGCTGCCGGAAATCCA3′；DMef2A1：5′GCGTCTGCAGCGTGACCACT3′．第二對（分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）：DMef2S2：5′GAGAATTCATGGGCCGCAAAAAAATTCA3′EcoRⅠ；DMef2A2：5′GGCTCGAGGTGGACTGGCCTGCAGCAGG3′XhoⅠ．

1.3基因克隆和載體構(gòu)建

選取30只野生型果蠅，液氮冷凍30min，用Trizol法提取總RNA［8］，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，獲得firstchaincDNA．然后以firstchaincDNA為模板用第一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以所得產(chǎn)物為模板，用第二對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段［9］．目的片段經(jīng)純化后克隆入T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，酶切檢測篩選出陽性單克隆，經(jīng)測序鑒定后將DNA片段從pMD18TMef2質(zhì)粒上切下，連入pET28a載體（EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化），得到陽性克隆，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aMef2．

1.4Mef2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

pET28aMef2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株Rosseta，篩選出陽性菌落，然后接種于LB培養(yǎng)基（含100mg/L氯霉素，卡那霉素）37℃培養(yǎng)12h左右，以1∶50轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，按0.1mol/L加IPTG，25℃誘導(dǎo)，4、5、6、7h各取1mL菌液，確定最佳誘導(dǎo)時間．

收集誘導(dǎo)后大腸桿菌，PBS漂洗后超聲裂解，離心取上清．4℃下與經(jīng)BindingBuffer漂洗活化后的NiIDA凝膠柱結(jié)合，WashingBuffer洗去雜蛋白，ElutionBuffer洗脫目的蛋白，獲得純化的HisMef2融合蛋白，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.5Mef2多克隆抗體制備

將純化后的HisMef2蛋白與弗氏完全佐劑按體積1∶1在注射器中推成乳劑，分散約12個點(diǎn)對同一新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下免疫注射．在第一次注射后14、21、28d，將HisMef2蛋白按體積比1∶1與弗氏不完全佐劑在注射器中推成乳劑，進(jìn)行多次免疫．第35天主動脈取血，靜置過夜（4℃），3000r/min離心處理10min，取上清分裝保存（-80℃）．

1.6效價測定

獲得免疫兔血清后，用誘導(dǎo)的總蛋白進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測抗體效價．將含pET28aMef2重組子的菌株在LB培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)，將5mL接種于200mL新鮮培養(yǎng)基中，用IPTG在25℃條件下誘導(dǎo)5h后，收集細(xì)菌，PBS重懸，然后用SDSPAGE電泳分離．將Mef2抗體分別以1∶100、1∶500、1∶1000和1∶2000的體積比稀釋后，以免疫前兔血清作為對照，采用Westernblotting方法檢測抗體的特異性［10］．

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pET28aMef2的構(gòu)建與鑒定

將純化后的果蠅Mef2基因片段克隆到pMD18T載體中，經(jīng)測序鑒定與基因理論序列100%匹配，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，連入pET28a載體（EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化），獲得重組質(zhì)粒pET28aMef2．經(jīng)酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒正確（圖1）．

2.2Mef2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組子轉(zhuǎn)入Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，以0.1mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，30℃條件下進(jìn)行時間梯度誘導(dǎo)1，2，3，4，5，6h分別取樣檢測蛋白的表達(dá)，結(jié)果（如圖2）顯示Mef2蛋白在誘導(dǎo)1h后就開始表達(dá)，隨著時間推移表達(dá)量增加，在3h后趨于穩(wěn)定．

3討論

為了以果蠅為模型進(jìn)一步研究Mef2基因的功能，本文通過試驗(yàn)獲得了Mef2原核表達(dá)融合蛋白，制備了高效價和特異性好的兔抗Mef2血清．在獲得融合蛋白的過程中，先通過軟件分析選取了親水性好而又含結(jié)構(gòu)域少的一段序列，為獲得特異性好的抗體提供了前提條件［12］．在誘導(dǎo)蛋白的過程中，IPTG的終濃度選取的是0.1mmol/L，蛋白表達(dá)量相對高，又不至于因IPTG濃度太高對細(xì)胞的生長產(chǎn)生毒性作用，試驗(yàn)相對容易成功．

pET28a（+）載體是一種常用的原核表達(dá)載體，具有Kan抗性，質(zhì)粒大小為5.3kb．載體的N端攜帶His標(biāo)簽、凝血酶基因及T7啟動子標(biāo)簽序列；在C端具有His標(biāo)簽序列，pET28a（+）載體可在BL21（DE3）、Rosstea等表達(dá)菌株中高表達(dá)融合有His標(biāo)簽的蛋白，便于下游蛋白純化．pET28a這種載體沒有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也沒有催化二硫鍵形成的酶融合蛋白，而且不含信號肽序列，所以同一種蛋白用這個載體，形成包涵體的可能性更大些［13］．

本試驗(yàn)中，作者通過構(gòu)建pET28aMef2重組質(zhì)粒、誘導(dǎo)表達(dá)HisMef2融合蛋白獲得了高純度的蛋白并免疫新西蘭大白兔制備了Mef2抗體．通過效價檢測證明制備的Mef2多克隆抗體具有較好的特異性，能滿足試驗(yàn)要求．因此，它為將來運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫組化等手段深入研究Mef2基因的功能奠定了基礎(chǔ)．

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