NF-κB在TNF誘導凋亡中的作用

王京 沈定霞

眾所周知，TNF可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。在這一過程中，NF-κB會被激活，同時還可抑制腫瘤細胞發(fā)生的凋亡[1-3]。細胞可以通過NF-κB這一通路產(chǎn)生抗凋亡效用和起到轉導信號的作用。NF-κB的研究日漸增多，其中在TNF誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的過程中的作用逐漸被重視。

1 NF-κB的定義

核轉錄因子（nuclear transcription factor）是一種能與啟動子區(qū)的固定核酸序列結合從而激活基因的轉錄功能的特殊蛋白質(zhì)。有一種核蛋白因子，能特異結合免疫球蛋白κ鏈基因上GGGACTTTCC這一增強子序列，然后促進細胞表達κ輕鏈，這種蛋白質(zhì)最早發(fā)現(xiàn)于B細胞的核提取物中，所以被稱做NF-κB。目前，將其歸為NF-κB/ReL蛋白家族成員，此家族成員目前包括以下幾類：（1）p50及其前體p105 （NF-κB1）；（2）p52及其前體p100 （NF-κB2）；（3）C-Rel；（4）P65 （RelA）和（5）RelB。此家族成員均包含一個氨基末端，包括DNA結合部位、二聚體化部位以及和IκB 結合的位點 -NLS（nuclear translocation signal），主要負責形成二聚體，與DNA以及抑制蛋白IκB結合，此氨基末端來源非常保守，由300個左右氨基酸組成，稱為Rel同源 區(qū)（rel homology domain，RHD） 或 NRD（NF-κB/ReL/dorsal）， RHD含有的NLS定位序列可以促使活化的NF-κB進入細胞核而實現(xiàn)本身的功能。NF-κB二聚體與DNA結合后，可形成一個有活性的結構。NF-κB/ReL蛋白大家族各成員之間可以形成同源的或異源二聚體，而這些蛋白二聚體不同的組成結構的結合序列也不相同，而且各自具有各自的特性，DNA靶目標的細微不同都可以被NF-κB二聚體的不同形式識別出來，從而使得面對不同的調(diào)節(jié)對象基因或序列時，NF-κB的不同亞單位形式的表達能力得到相應的保證。根據(jù)文獻報道，功能性NF-κB的結合位點在諸如IL22、IL26、IL28、TNF、TNFβ、ICAM21、GM2CSF等許多基因的啟動子或增強子上都具備了[4]。比如P50與P65這一二聚體結合的序列為5′ GGGRNNYYCC3′，此為NF-κB的標準形式； 5′ HGGARNYYCC3′這一序列則是 RelA/C-Rel二聚體的結合序列，其中R為嘌呤，Y為嘧啶，H代表A、C或T。在眾多的NF-κB蛋白形式中，是負責激活轉錄的NF-κB復合體形式為P50/P65、P50/C-ReL、P65/C-ReL，而負責抑制轉錄的復合體形式是P50同源二聚體和P52同源二聚體。

2 NF-κB被激活的途徑及其與TNF之間的聯(lián)系

NF-κB在非激活條件下，以一種無活性形式存在于細胞漿內(nèi)。此時NF-κB與NF-κB的抑制蛋白形成一種復合物。NF-κB是一種可被誘發(fā)的轉錄調(diào)節(jié)因子，其結合位點可以接受到種類繁多的免疫刺激，這其中常見的有病毒感染、T細胞激活劑、生長因子、IL21、LPS以及TNF等，這些因素均可輕松激活NF-κB[5]。IκB家族成員有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ等，均為抑制NF-κB主要的蛋白。該家族擁有5～7個錨蛋白重復序列和C端PEST序列，錨蛋白重復序列與Rel蛋白相互作用，C端PEST序列和降解密切相關。NF-κB的核定位信號一般被IκB所掩蓋，以無活性的形式在胞漿中被IκB滯留[6]。目前的研究以IκBα居多且詳細深入，NF-κB的主要調(diào)控抑制蛋白就是IκBα，與它之具備有高親和力的主要是含有RelA和C-Rel的二聚體，其他Rel與它的親和力相對低很多。NF-κB/ReL的Rel同源區(qū)的氨基酸殘基主要與它發(fā)生相互作用，從而掩蓋了IκB結合的位點NLS，抑制了核易位使NF-κB滯留于胞漿。IκBα、IκBγ和IκBδ可與Rel蛋白中p50的前體p105以及p52的前體p100作用，因為其蛋白C端擁有錨蛋白重復序列，可經(jīng)此重復序列與ReL蛋白N末端RHD產(chǎn)生二聚體化從而滯留在細胞漿。當胞外產(chǎn)生一個諸如TNF結合等的刺激以后，刺激再通過一或多個信號轉錄途徑，激活了蛋白激酶，作用于原來以失活形式存在于胞漿中的NF-κB三聚體復合物，使其中的IκBα磷酸化，三聚體發(fā)生解離，IκBα游離出來，與泛素結合，變成泛素化的IκBα，其再被蛋白酶小體降解，最終使得二聚體NF-κB發(fā)生核轉位[7]。此外還有一類IκB蛋白，即BCL-3，是跟獨特的NF-κB二聚體產(chǎn)生交互作用，從而產(chǎn)生轉錄活性。BCL-3為一新發(fā)現(xiàn)蛋白，其位于細胞核，協(xié)同P50或P52同源二聚體發(fā)揮激活轉錄作用，而非抑制核易位或抑制DNA結合作用。不過BCL-3不能與P50的NLS區(qū)域結合[8]，這一結果與NF-κB和IκBα的相互作用是相反的。

目前，對激活NF-κB機制的研究逐漸透徹，已發(fā)現(xiàn)數(shù)個抗凋亡基因被NF-κB上調(diào)，而且現(xiàn)在對于NF-kB如何被各種細胞外誘導因素激活，和激活后信號如何傳導到下游，以及各傳導通路的共同交匯點已一些相對基本的常識。NF-κB的活化一般分成3條通路：（1）生存因子先與TRADD聚集，然后TRADD再與TRAF2結合，從而活化NIK（NF-κB inducing kinase，NF-κB誘導因子），NIK進一步活化IKκB復合物，使IκB迅速磷酸化，泛素化降解，釋放NF-κB迅速發(fā)生核轉位。而酪氨酸激酶可能在TRAF2活化NF-κB的過程中起重要作用[9]。（2）受體酪氨酸激酶（RTK）被生存因子信號激活，進而活化RAS-MEK信號通路，通過受體相互作用蛋白（RIP）MEK參與NIK的活化，最后促進NF-κB活化。此通路需要在shc/sos參與下。（3）PI3K被生存信號激活后，AKT使IκB磷酸化，致使其從NF-κB上分離，使NF-κB活化。AKT抑制劑可抑制NF-κB的活化。不同的刺激因素，活化NF-κB可能具有不同的通路，IκB的磷酸化即是各不同通路之間的共同點。如IL-1，TNF及LPS等典型的刺激炎癥因子促使IkBα等IkBs產(chǎn)生磷酸化和降解的過程一般發(fā)生在數(shù)分鐘以內(nèi)。最初IkBα由激酶復合物IKK作用，在Ser32和Ser36兩個位點[9-10]上發(fā)生磷酸化。IkBα磷酸化以后，迅速在分子中的Lys21及Lys22兩個位點上發(fā)生泛素化[11-12]，這一過程由泛素連接酶復合物SCF（Skp-1/Cul/F-box）大家族成員中一個E3RSIkB/b-TrCP識別[13]。26S蛋白酶體能夠識別泛素化的IkBα分子，并迅速降解之。IkBα降解以后，NF-κB即能從三聚體復合體中被釋放和活化，活化的NF-kB暴露出其核定位序列來，然后即能迅速轉位，進入細胞核，發(fā)揮轉錄啟動功能。IKK復合物是由兩個活性亞基IKKα和IKKβ以及一個調(diào)節(jié)性亞基IKKγ共同組成。Knockout實驗證明，IKKβ和IKKγ也是NF-kB被炎癥因子激活過程中不可缺少的成分。

活化的NF-κB發(fā)揮啟動轉錄的功能后，將作用于各種特異的靶基因，誘導這些靶基因的表達，編碼不同的前炎性蛋白質(zhì)，諸如生長因子，IFN，細胞因子，細胞粘附因子等，誘導C-IAH，C-IAP2等凋亡抑制蛋白的基因表達，抑制一氧化氮合酶NOS的生成，誘導Bcl-x1，Bcl-2這些抗凋亡基因的表達。于細胞內(nèi)外均可發(fā)生針對NF-κB的反饋調(diào)節(jié)，NF-κB的活化能夠增加TNF、IL-1β等的轉錄水平，并且轉錄產(chǎn)物又可以反過來繼續(xù)活化NF-κB。這就是通過細胞外機制放大刺激信號的正反饋。IκBα、p105基因的轉錄上調(diào)是對NF-κB的負反饋調(diào)節(jié)。細胞內(nèi)NF-κB的活化，水平提高，會對此二基因上有作用，因為二者結構中均含有NF-κB的作用位點。P50二聚體隨著p105的增加而增加，因為p50二聚體缺乏轉錄激活區(qū)域且不能與IκB有效結合，還可以通過競爭結合NF-κB結合位點來減少其他Rel蛋白與NF-κB的結合并抑制NF-κB介導的基因轉錄表達。因此，P50二聚體可以降低NF-κB的介導效果。這就是負反饋之一。此外負反饋也可由反向細胞因子來實現(xiàn)，這是細胞外刺激如IL-10、TNF或者IL-1等產(chǎn)生的。IL-10抑制NF-κB活化的過程是通過抑制內(nèi)毒素實現(xiàn)的，也可達到抑制NF-κB進而降低某種細胞因子產(chǎn)生的效果[8]。

TNF-α與TNF-R1的結合能夠激活PC-specific phospholipase C （PC-PLC），然后產(chǎn)生1，2二?；视停?，2DAGs），1，2二酰基甘油（1，2DAGs）在順序活化酸性鞘磷脂酶（acidic smase，SM）和蛋白激酶C（PKC）。這兩種酶的作用途徑并不一致，酸性鞘磷脂酶水解鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺（ceramide），神經(jīng)酰胺可快速誘導NF-κB活化，通過一種尚未完全明確的途徑，而蛋白激酶C活化NF-κB則通過其他途徑。把NF-κB的調(diào)控信號分子（如TRAF2、ceramide）如何功能性地與TNF受體相關蛋白聯(lián)系在一起是一個仍待研究的問題。

3 抑制NF-κB能使細胞對TNF更為敏感

對NF-κB的認識最初只限于細胞死亡相關等[10]。在應激、免疫和炎癥刺激方面的作用也逐漸認識。小鼠缺乏NF-κB以后，觀察到其肝臟細胞發(fā)生凋亡等退行性變，猜測這種現(xiàn)象可能與NF-κB有關，具體作用可能與胚胎細胞的凋亡能被NF-κB抑制相關，進而推論出NF-κB也可以降低腫瘤細胞的凋亡。許多腫瘤細胞中NF-κB的表達量非常高，細胞因子也有高量的表現(xiàn)，同時還表現(xiàn)出能抵抗TNF、射線、化療等介導凋亡的作用。NF-κB含量的增加、細胞因子的產(chǎn)生以及細胞對凋亡的抵抗力之間存在著一定的密切關系，提示它們之間有一種內(nèi)在的恒定聯(lián)系。

給裸鼠移植大腸腺癌后再將NF-κB decoy腹腔注射，結果發(fā)現(xiàn)NF-κB decoy雖然沒有影響腫瘤生長，卻可抑制腫瘤引發(fā)的惡病質(zhì)。進一步實驗發(fā)現(xiàn)IL-6等細胞因子表達降低，這些因子與腫瘤惡病質(zhì)效果是有關的。通過腺病毒載體將IκBα基因轉染Jurkat、MEF細胞株，然后再用TNF-α處理，與對照組（單用TNF-α處理）作比較，凋亡率結果為MEF細胞株67%與8%，Jurkat細胞株44%與4%[9]。在前列腺癌細胞株DU145、PC3中，一組用TNF-α蛋白處理，另一組分別用NF-κB decoy和PDTC（pyrrolidine dithiocarbamate）聯(lián)合處理細胞，結果發(fā)現(xiàn)，而單用TNF-α 50 ng/ml者，細胞生長正常，而NF-κB decoy聯(lián)合TNF-α處理組中，細胞凋亡明顯增加，TNF-α用量可減至20 ng/ml?？梢娐?lián)合應用NF-κB可以降低TNFα試用劑量并提高作用效果，而單純抑制NF-κB卻不能將腫瘤細胞直接殺傷[14]。在人前列腺癌裸鼠移植瘤動物模型上，聯(lián)合應用全硫代修飾的NF-κB抑制劑-雙鏈κB序列（AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC）與TNF-α基因進行治療實驗，結果比較與單用TNF-α基因治療的對照組有顯著性差異，前者抑瘤率近2倍于后者，單用NF-κB抑制劑結果同樣對腫瘤生長無影響。可見直接誘導腫瘤生長進展并不是NF-κB的作用，但作為轉錄激活因子，NF-κB會對產(chǎn)生這些細胞因子從基因水平發(fā)揮作用。研究證明，PC-3和DU145等細胞系可以表達諸如GM-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8等多種不同的細胞粘附因子和細胞分子，這些因子在腫瘤細胞的生存、生長中起不同的重要維持作用。NF-κB被活化后，轉錄調(diào)控不同的細胞分子，從而產(chǎn)生不同的效應，這些均被以上實驗證實。不過也有不同的聲音，在肺鱗狀細胞癌，應用攜帶IκBα基因的腺病毒載體做轉染處理，結果腫瘤細胞的生長被深度抑制，在其他實驗中也發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細胞的生長可以被單純轉染IκBα所抑制，但這一結果不能適用于所有情況，討論中認為可能與某些細胞因子的產(chǎn)生從而導致腫瘤存活有關，也可能與細胞類型的不同和實驗因素影響體內(nèi)外環(huán)境不同相關[15]。

通過轉錄上調(diào)癌基因，NF-κB能促進腫瘤的存活，如bcl-2和ras的上調(diào)表達，并在介導細胞存活和轉化中起到作用等等[11-12]。單獨使用NF-κB decoy或IκBα，能夠抑制腫瘤生長，或者在多大程度上抑制生長，這些還需要做深層次的研究。但是，抑制NF-κB能使腫瘤細胞對TNF更為敏感，這一點是很肯定的。TNF-α需要抑制蛋白的參與來促進和誘導凋亡。某些腫瘤細胞對TNFα具有天然抗性，如能通過NF-κB的激活，上調(diào)一些相關基因的轉錄，來編碼抑制凋亡的蛋白，來促進TNF-α對caspase-8的激活，即可增敏腫瘤細胞的TNF的反應。有幾個基因c-IAP1&2、TRAF1&2可在此發(fā)揮作用。TNFα通過破壞腫瘤微血管系統(tǒng)導致壞死和凋亡誘導這兩個方面因素來使腫瘤消減加速[16]。前者目前研究較少，但誘導凋亡的研究有很多。實驗證明，IκBα聯(lián)合TNFα治療，可使85%的動物體內(nèi)瘤體完全消減，代之以瘢痕，對照組這一數(shù)據(jù)僅為15%。

雖然聯(lián)合應用NF-κB抑制劑可提高TNF抗腫瘤藥物的效果，目前將NF-κB實際應用于臨床仍有幾個問題。一是NF-κB是一個廣泛存在的分子，對它的抑制可使非腫瘤組織受到非特異性負面作用[15]。人工合成的NF-κB活性抑制劑如NF-κB decoy等，多數(shù)會發(fā)生很大的副作用，這些往往是由于那些非特異性的活性引起的。有報道已發(fā)現(xiàn)非轉化細胞發(fā)生了凋亡是由于IκBα基因轉染引起的[17]。二是需要提高IκBα基因治療的轉化效率來達到更好的成功率，但目前并不存在轉化效率達到100 %的載體，因此，能夠篩選出一種轉化率高的載體變得很重要?，F(xiàn)在大家正在探索的新的研究方向，一種就是找到天然存在的NF-κB 活性抑制劑，再一種方法就是共同聯(lián)合其他凋亡基因，這也可能會產(chǎn)生超出預期的好效果。有研究用FADD基因轉染也可以使腫瘤細胞發(fā)生凋亡[18]，推想如果能將NF-κB抑制劑與FADD聯(lián)合應用會有好效果。

這些在NF-κB研究領域取得的成果，為TNF抗腫瘤的應用提供新的思路。預期未來NF-κB在提高TNF效應，減少TNF用藥量、降低TNF的毒副作用方面會發(fā)揮其關鍵作用。綜合文獻報道，NF-κB的功能涉及到多種病理過程[19-21]。雖然某些信號通路研究和作用機制已取得大量數(shù)據(jù)，但是NF-κB家族與IκB家族成員眾多，靶細胞類型多種多樣，信號轉導通路多且繁雜，各種通路所需要的具體分子存在差異，NF-κB深層次的作用機制與原理還有待更多更深入的研究[22-25]。相信今后經(jīng)過研究人員的不懈努力，NF-κB與機體、細胞、蛋白、基因和分子之間的調(diào)節(jié)作用與相互機制會得到進一步完善和提高，在TNF抗腫瘤的應用中能夠越來越成熟。

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