原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)分析*

向國(guó)艷，樊 佳，葉震璇，付 雪，李紅梅，張 華，4△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨檢教研室，貴陽(yáng) 550004；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴陽(yáng) 550004；4.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550002)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種漸進(jìn)性發(fā)展的慢性自身免疫性肝臟疾病，以肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管上皮細(xì)胞特異性損傷及血清中出現(xiàn)高滴度抗線粒體抗體為特征[1]。好發(fā)于中年女性，起病隱匿且病程長(zhǎng)。其病因尚不完全清楚，可能與遺傳易感性及環(huán)境等因素有關(guān)。熊去氧膽酸(ursodeoxy-cholic acid，UDCA)是目前唯一被美國(guó)肝病學(xué)會(huì)(AASLD)、食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于治療PBC的有效藥物[2]，但仍有患者治療效果欠佳，最終需要肝臟移植。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指一類核苷酸超過(guò)200個(gè)堿基、不編碼蛋白質(zhì)的功能性非編碼RNA分子[3]。研究表明，lncRNA可通過(guò)表觀遺傳修飾與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控等多種機(jī)制，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。其功能失調(diào)時(shí)與腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕等[4-6]疾病的發(fā)生、發(fā)展都有著密切的關(guān)系。近年來(lái)關(guān)于lncRNA的研究發(fā)展迅猛，但也只是冰山一角，絕大部分lncRNA的功能仍然未知。lncRNA關(guān)于PBC的研究則更是鮮有報(bào)道，現(xiàn)有的研究也是采用基因芯片的方法[7]。而基因芯片的假陽(yáng)性率很高，也不能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。因此，本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)并分析PBC患者和健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異，為PBC的研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年8-12月就診于貴州省人民醫(yī)院的PBC患者30例(PBC組)，男2例、女28例，平均年齡(50.20±10.94)歲。另選取同期于貴州省人民醫(yī)院健康體檢中心受檢的30例健康者(對(duì)照組)，男2例、女28例，平均年齡(54.00±11.64)歲。兩組間年齡與性別分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(2017109)，且所有患者均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照2009年AASLD推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：系統(tǒng)性疾病引起的肝臟病變、自身免疫性疾病、藥物和膽道梗阻等引起的肝臟病變等。

1.2材料與試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅡ試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；QUBIT RNA ASSAY KIT購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre)購(gòu)自美國(guó)NEB公司；RNA 6000 Pico chip購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；lncRNA測(cè)序、圖像采集、數(shù)據(jù)分析等由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.3方法

1.3.1PBMC的收集 采集PBC患者與對(duì)照組外周靜脈血3～5 mL，3 500 r/min離心10 min，收集血漿于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。通過(guò)Ficoll分離法分離PBMC，并加1 mL Trizol凍存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2總RNA的提取、RNA文庫(kù)建立及測(cè)序 Trizol法提取總RNA，QUBIT RNA ASSAY KIT對(duì)起始的總RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre)對(duì)總RNA中rRNA 進(jìn)行分離去除，RNA 6000 Pico chip對(duì)去除 rRNA的總RNA進(jìn)行質(zhì)控，構(gòu)建好去除rRNA的質(zhì)控轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)后上機(jī)進(jìn)行RNA-seq。

1.3.3測(cè)序結(jié)果的處理和分析 采用NGSQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和統(tǒng)計(jì)。Cuffquan和Cuffnorm軟件進(jìn)行表達(dá)水平分析，geometric方法對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。差異RNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2FC|≥1且P<0.05，即PBC組比對(duì)照組表達(dá)變化在2倍以上且P<0.05。對(duì)篩選出的差異RNA做層次聚類分析?；虮倔w(GO)功能分析與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG分析)對(duì)差異表達(dá)mRNA的功能屬性及生物學(xué)途徑進(jìn)行富集分析，顯著富集是指P<0.05。根據(jù)差異表達(dá)基因、GO分析及KEGG分析的結(jié)果進(jìn)行蛋白互作分析。經(jīng)靶基因Cis-分析和Trans-分析預(yù)測(cè)可能與PBC相關(guān)的lncRNA。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異RNA的表達(dá)水平 選取PBC患者與健康對(duì)照各30例，經(jīng)RNA/DNA/蛋白共提取試劑盒嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)提取PBMC中的RNA，并用nondrop檢測(cè)RNA的濃度和純度。根據(jù)GeneBank設(shè)計(jì)引物，序列見(jiàn)表1。采用SYBR Green染料，通過(guò)2-ΔΔCt法分析目的基因的表達(dá)水平。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 lncRNA NONHSAT250451.1、EGR1和GAPDH引物

EGR1：早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶

A、B：分別為差異表達(dá)mRNA與lncRNA的火山圖；C、D：分別為差異表達(dá)mRNA與lncRNA的聚類分析圖；紅色：上調(diào)；綠色：下調(diào)，黑色：無(wú)差異

圖2 差異表達(dá)RNA的火山圖與聚類分析圖

2 結(jié) 果

2.1總RNA質(zhì)檢結(jié)果 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的10個(gè)RNA樣品，RNA總量大于或等于5 μg，260 nm與280 nm處吸光度比值(A260/280)在1.8～2.1范圍內(nèi)。甲醛變性膠和Agilent 2100電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，電泳條帶清晰，rRNA比值(28 s/18 s)≥1.5∶1.0；RIN≥7。受檢的所有RNA樣品基本符合Illumina RNA-Seq樣品建庫(kù)的實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)照組以D2和D3為例，實(shí)驗(yàn)組以T1和T2為例，見(jiàn)圖1。

2.2差異表達(dá)RNA聚類分析 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(|log2 FC|≥1且P<0.05)，差異的mRNA共5 143個(gè)(2 318個(gè)上調(diào)和2 825個(gè)下調(diào))，差異的lncRNA共716個(gè)(367個(gè)上調(diào)和349個(gè)下調(diào))。差異表達(dá)RNA的火山圖與聚類分析圖，見(jiàn)圖2。

2.3GO功能分析 差異基因在GO功能分析：其中Biological Process富集到3 213個(gè)term、Cell Component富集到230個(gè)term，以及Molecular Function富集到354個(gè)term。共富集到的3 797個(gè)term中多數(shù)與炎癥、免疫活性及代謝等功能有關(guān)。差異基因和背景基因在GO功能分析的每個(gè)二級(jí)條目上的分布情況，見(jiàn)圖3。

2.4KEGG分析 共顯著富集到33個(gè)term，在organismal system中富集到與免疫系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路有TCR信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。在Environmental Information Processing中富集到了與免疫相關(guān)的信號(hào)通路有核因子-κB (NF-κB)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、Jak-STAT 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等，見(jiàn)圖4。

圖3 GO二級(jí)頻率圖

圖4 差異基因KEGG通路分類示意圖

A:差異表達(dá)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)總圖；B：EGRI及其相關(guān)調(diào)控基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5蛋白互作分析與靶基因預(yù)測(cè) 蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(EGR1)是差異mRNA中唯一的轉(zhuǎn)錄因子，且與白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-2等炎性因子及MAPK13、叉頭蛋白3(FOXO3)等相互作用，見(jiàn)圖5。另外，靶基因Cis-分析預(yù)測(cè)到lncRNA NONHSAT250451.1對(duì)EGR1具有靶向調(diào)控作用。

2.6lncRNA NONHSAT250451.1與EGR1表達(dá)情況 PBC組患者PBMC中l(wèi)ncRNA NONHSAT250451.1與EGR1表達(dá)分別為對(duì)照組的7.26、3.91倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

A:lncRNA NONHSAT250451.1；B:EGR1

圖6 lncRNA和EGR1的相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

PBC是一種以免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)小膽管漸進(jìn)性破壞、慢性膽汁淤積為特征的肝臟疾病[1]。2015年被更名為原發(fā)性膽汁性膽管炎，這更準(zhǔn)確地反映了絕大多數(shù)患者的疾病自然史[8]。目前PBC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，較為公認(rèn)的假說(shuō)是在遺傳及環(huán)境等因素相互作用下，機(jī)體免疫耐受屏障破壞而引發(fā)PBC?？梢?jiàn)PBC具體發(fā)病機(jī)制有待于繼續(xù)探索。

lncRNA是指一類核苷酸超過(guò)200個(gè)堿基、不編碼蛋白質(zhì)的功能性非編碼RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的lncRNA參與了多種疾病的發(fā)生，如PCA3是一個(gè)前列腺癌特異表達(dá)的lncRNA，在前列腺癌患者尿液中異常升高，已經(jīng)用于臨床前列腺癌診斷[4]。lncRNA GAS5、linc0597和lnc-DC等在SLE患者血漿中高表達(dá)，有望成為SLE新的診斷標(biāo)志物[5]?？梢?jiàn)，疾病中差異表達(dá)的lncRNA有可能成為疾病的診斷標(biāo)志物和潛在的藥物治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，篩選PBC患者外周血PBMC中差異表達(dá)的lncRNA，尋找可能與PBC發(fā)病相關(guān)且特異的lncRNA。

研究顯示，共富集到差異表達(dá)的lncRNA 716個(gè)，差異表達(dá)的mRNA 5 143個(gè)。GO功能分析與KEGG分析發(fā)現(xiàn)，顯著差異表達(dá)的mRNA與炎癥、免疫活性、代謝等功能及多種免疫信號(hào)通路相關(guān)(如TCR、NF-κB和Jak-STAT等信號(hào)通路)。免疫細(xì)胞及免疫相關(guān)信號(hào)通路(如TCR信號(hào)通路)的異常激活都可能是參與PBC發(fā)病的原因之一[9]。其中，差異表達(dá)基因EGR1與免疫細(xì)胞增殖、分化有關(guān)，其激活與否受TCR信號(hào)通路的影響[10]。因此筆者猜想EGR1可能與PBC發(fā)病相關(guān)。而且蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，EGR1與IL-1β、IL-2、IL-6和FOXO3等相互作用。FOXO3可以與FOXP3結(jié)合導(dǎo)致機(jī)體調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)數(shù)量異常[11]，進(jìn)而打破體內(nèi)免疫平衡促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生。IL-1β、IL-2、IL-6等炎性因子也都與PBC的發(fā)病相關(guān)[12-13]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)EGR1可以直接與輔助性T 淋巴細(xì)胞1(Th1)細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，促進(jìn)T-bet轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖及干擾素-γ(IFN-γ)的大量釋放[10]。而KAWATA等[14]發(fā)現(xiàn)IFN-γ的缺失極大地抑制了膽管炎的發(fā)展，說(shuō)明Th1介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)在致PBC肝臟病變過(guò)程中具有重要作用。Th1/Th2比例失衡是PBC主要發(fā)病機(jī)制之一[15]?？梢?jiàn)，EGR1可能是通過(guò)影響Th1/Th2比例，以及與多種炎性因子的相互作用來(lái)參與PBC的發(fā)生。

靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA NONHSAT250451.1在EGR1基因上游4 297 bp左右的位置處以Cis調(diào)控(Antisense)的方式對(duì)EGR1進(jìn)行調(diào)控。而且，通過(guò)NONCODE數(shù)據(jù)庫(kù)確定NONHSAT250451.1確實(shí)為lncRNA。因此筆者推測(cè)，lncRNA NONHSAT250451.1可能是通過(guò)調(diào)控EGR1的表達(dá)來(lái)參與PBC的發(fā)生，其在PBC中發(fā)揮的作用有待于進(jìn)一步的探討。實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，lncRNA NONHSAT250451.1與EGR1在PBC患者PBMC中的表達(dá)水平較對(duì)照組分別高出7.26、3.91倍，與測(cè)序結(jié)果一致。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)lncRNA NONHSAT250451.1與EGR1在PBC患者中存在明顯的差異，有望成為PBC的診斷標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)候選者之一。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了許多顯著差異表達(dá)的lncRNA，如XLOC_000016上調(diào)了21.27倍，XLOC_117137上調(diào)了19.22倍，XLOC_072647下調(diào)了22.23倍，XLOC_039465下調(diào)了14.32倍。這些lncRNA在PBC中均未見(jiàn)報(bào)道，但是它們?cè)赑BC組中的表達(dá)差異非常顯著，可能對(duì)PBC的發(fā)生、發(fā)展有著重要的調(diào)控作用，在后續(xù)的研究中值得進(jìn)一步的挖掘。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了很多差異表達(dá)的lncRNA，并經(jīng)文獻(xiàn)找到可能與PBC發(fā)病相關(guān)的mRNA，猜想與之相關(guān)的lncRNA可能也與PBC的發(fā)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了EGR1及對(duì)其有靶向調(diào)控作用的lncRNA NONHSAT250451.1。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討lncRNA NONHSAT250451.1在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用，期望為以后PBC的診斷和治療提供新思路。