應(yīng)用HPLC-ICP-MS法同時測定富硒大蒜中砷的形態(tài)

陳晞，何桂華，韓煥美，鄭新華，張愛霞

（1.濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南250014；2.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟南250014）

硒是人體必需的微量元素，對預(yù)防疾病、增進(jìn)健康和防止衰老具有重要意義，被譽為“生命的保護劑”[1]。由于富硒蔬菜具有高產(chǎn)量、高附加值的優(yōu)勢，且植物源性有機態(tài)硒更安全、更有效，是人體攝入硒的最有益途徑，因此富硒蔬菜成為目前蔬菜產(chǎn)品開發(fā)的熱點[2]。然而，富硒地區(qū)土壤常伴生重金屬污染，作物吸收一定濃度硒元素的同時會加劇對重金屬元素的富集，嚴(yán)重影響蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全[3]。

砷元素是重金屬主要污染物之一，各種砷化物毒性與其形態(tài)密切相關(guān)，無機砷（As（Ⅲ）和As（V））毒性最強，有機態(tài)的一甲基砷、二甲基砷等毒性較低，砷糖、砷膽堿等有機砷類無毒。大蒜是對硒元素有較強的富集作用，其硒含量約為其他蔬菜的10 倍左右，通過攝入富硒大蒜可有效改善人體缺硒狀況。在大蒜種植過程中施加硒元素可提高砷元素的轉(zhuǎn)移效率，增加砷元素在大蒜中的含量，影響產(chǎn)品質(zhì)量安全。因此，準(zhǔn)確檢測富硒大蒜中的無機砷含量對提高富硒大蒜產(chǎn)品質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義，對我國制訂富硒蔬菜產(chǎn)品生產(chǎn)規(guī)范提供了檢測依據(jù)。課題組在前期工作基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)測定了富硒大蒜中五種砷的形態(tài)，分離效果和定量結(jié)果均令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

富硒大蒜：超市采購，產(chǎn)地分別為濟南、濰坊、萊蕪；砷酸根（32.4 μmol/g）、亞砷酸根（124.3 μmol/g）、一甲基砷（46.2 μmol/g）、二甲基砷（0.706 μmol/g）、砷甜菜堿標(biāo)液（0.518 μmol/g）：中國計量科學(xué)研究院；硝酸銨、磷酸氫二銨：國產(chǎn)優(yōu)級純。實驗用水為Millipore 超純水機制備的超純水，符合GB 6682-1992《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》所規(guī)定的一級水標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與設(shè)備

7500cx 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、1200 高效液相色譜：美國安捷倫公司；高速冷凍離心機：日本日立公司；刀式研磨儀：德國萊馳公司；恒溫水浴搖床：美國熱電公司；精密酸度計：上海雷磁儀器廠；AL104 分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 前處理方法

取富硒大蒜可食部分，使用刀式研磨儀粉碎均勻。準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 超純水，渦流混勻，超聲萃取40 min，于4 ℃下轉(zhuǎn)速8 000 r/min 冷凍離心15 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜上機測定。同時進(jìn)行試劑空白試驗。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac As11 陰離子色譜分析柱（含保護柱）；流動相：5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液+10 mmol/L硝酸銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 為9.2）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量40 μL。

1.3.3 ICP-MS 條件

RF 功率：1 600 W；載氣流速：15 L/min；輔助氣流速：1 L/min；霧化氣流速：1 L/min；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.3 r/min；采樣深度：8.0mm；提取透鏡：-120V；Omega 透鏡：-16V。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

分別用超純水將砷甜菜堿、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亞砷酸根的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋，配制成0、1.0、10.0、20.0、50.00 和100.0 ng/mL 的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列，超純水為標(biāo)準(zhǔn)空白。采集空白及標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，計算各色譜峰的積分面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

常見砷形態(tài)的離解常數(shù)pKа 分別為：亞砷酸根（As（III））：9.2；砷酸根（As（V））：2.3、6.8、11.6；一甲基砷酸（MMA）：2.6、8.2；二甲基砷酸（DMA）：6.2；砷甜菜堿（AsB）：2.2。由此可見各形態(tài)均可電離成離子態(tài)，且各形態(tài)解離常數(shù)差別較大，故可選用陰離子色譜柱分析。

磷酸鹽作為常用陰離子淋洗液，作為無機砷的基礎(chǔ)淋洗液較為合適?？紤]到與鈉鹽相比，銨鹽對ICPMS 采樣錐和截取錐的傷害更小，故選擇磷酸氫二銨作為基礎(chǔ)淋洗液。大蒜樣品中氯化物含量較高，加入硝酸銨可以改變氯離子的出峰時間，避免氯化物對As測定的干擾；同時，硝酸銨也可改善As（V）的保留時間。有文獻(xiàn)表明在加入甲醇或乙醇后As 測定的靈敏度可增高[4]，但實驗發(fā)現(xiàn)，有機試劑的加入對陰離子柱和ICP-MS 的炬管、采樣錐壽命均有明顯影響，導(dǎo)致檢測成本過高。經(jīng)優(yōu)化，最終選擇5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液+10 mmol/L 硝酸銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 為9.2）作為流動相。為提高檢測靈敏度，將進(jìn)樣量增大到40 μL。

圖1 為流動相流速1.0 ml/min 時5 種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品（50 μg/L）分離的色譜圖（a）和大蒜樣品測量譜圖（b）。由圖1 可知，5 種形態(tài)砷完全基線分離，峰型對稱、尖銳，保留時間穩(wěn)定，可以滿足實際樣品檢測需要。

圖1 5 種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（a）和大蒜樣品測量譜圖（b）Fig.1 Chromatogram of five arsenic species（a）and of the garlic sample

2.2 ICP-MS 條件優(yōu)化

考慮到砷的電離能較高，將RF 功率適當(dāng)增高至1 600 W，保證砷的各形態(tài)均可完全解離以滿足測定要求。因聯(lián)機后流動相流速達(dá)1.0 mL/min，為避免廢液不能及時排出對儀器造成損壞，將蠕動泵轉(zhuǎn)速提高至0.3 r/min。聯(lián)機前，使用1.0 mg/L 的Li、Y、Co、Ce、Tl 混合調(diào)諧液對ICP-MS 進(jìn)行調(diào)諧，調(diào)整載氣流速、采樣深度、炬管位置、透鏡參數(shù)等指標(biāo)，以保證儀器的最佳狀態(tài)和儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。調(diào)諧后，儀器靈敏度明顯提高，中質(zhì)量數(shù)（Y）>500 Mcps/ppm，同時使氧化物CeO/Ce<3%，雙電荷產(chǎn)率Ce2+/Ce+<1.5%。

2.3 提取條件優(yōu)化

試驗比較了鹽酸提取、沸水提取、超聲提取3 種處理方式的提取效果。結(jié)果表明，鹽酸提取液氯離子濃度過高，解離后出現(xiàn)極寬的干擾峰，造成標(biāo)準(zhǔn)品峰形無法分辨，基線漂移漂移嚴(yán)重，無法達(dá)到定量分析的要求，故不采用該方式提取。

圖2 為沸水提?。╝）和超聲萃?。╞）時提取時間對5 種砷形態(tài)回收率的影響。

圖2 沸水提?。╝）和超聲萃?。╞）時提取時間對5 種砷形態(tài)回收率的影響Fig.2 Effect of the time on the recoveries of 5 arsenic species with extraction of boiling water（a）and ultrasonic（b）

由圖2 可見，沸水提取時，提取效率與時間密切相關(guān)，短時間內(nèi)砷酸根和亞砷酸根的提取效率隨時間延長而提高，但時間延長至40 min 左右時，部分亞砷酸根氧化為砷酸根，回收率反而降低，該方法耗時長、無機砷回收不穩(wěn)定，有機砷回收率也不高，需進(jìn)一步優(yōu)化。超聲萃取具有耗時短、樣品無交叉污染，適合批量樣品測定，經(jīng)加標(biāo)回收實驗，超聲萃取40 min，5 種形態(tài)的砷回收率均在90%以上，滿足檢測需要。

2.4 工作曲線和方法檢出限

對濃度分別為0、1.0，10.0、20.0、50.00、100.0 ng/mL的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-ICP-Ms 分析，以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，在該濃度范圍內(nèi)，5 種砷形態(tài)的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋，以10 倍信噪比（S/N）作為定量檢出限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

表1 5 種砷形態(tài)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5 回收率與精密度

選取市售富硒大蒜，采用微波消解-ICP-MS 法測定其總砷含量，選擇總砷含量為未檢出者作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。取空白的富硒大蒜樣品可食部分，使用刀式研磨儀粉碎均勻。準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，分別加入0.50、1.0、50.0 μg/kg 5 種形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20 mL 超純水，渦流混勻，超聲萃取40 min，于4 ℃下轉(zhuǎn)速8 000 r/min 冷凍離心15 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜上機，測定并計算回收率和精密度（n=6）。測得平均回收率范圍在89.5%～108.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.68%～4.2%之間（見表2）?？瞻状笏鈽悠罚╝）和加標(biāo)大蒜樣品（b）的HPLC-ICP-MS 色譜圖見圖3，加標(biāo)濃度50 μg/kg。

表2 5 種形態(tài)砷標(biāo)液的添加回收率和精密度（n=6）Table 2 Spiked recoveries and precisions for 5 arsenic species（n=6）

圖3 空白樣品（a）和加標(biāo)樣品（b）的HPLC-ICP-MS 色譜圖Fig.3 HPLC-ICP-MS chromatograms of the blank sample（a）and the sample spiked with 5 arsenic species（b）

2.6 市售富硒大蒜樣品檢測

選購市售富硒大蒜樣品，按所建立的HPLC-ICPMS 方法測定5 種砷的形態(tài)，同時測定總砷含量，結(jié)果見表3。

表3 市售富硒大蒜檢測結(jié)果Table 3 Analytical results of selenium-enriched garlic μg/kg

結(jié)果表明，富硒大蒜中的砷元素主要以MMA 形態(tài)存在，另有少量五價砷。研究表明，一甲基砷酸毒性與As（III）和As（V）相比更低，較二甲基砷、砷糖、砷膽堿毒性更高[5]?？偵楹勘? 種形態(tài)砷元素檢測結(jié)果總和略高，應(yīng)是無毒的砷糖、砷膽堿類存在。所測富硒大蒜中總砷含量均很低，遠(yuǎn)低于GB 2762-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》所規(guī)定的總砷≤0.5 mg/kg。這與富硒蔬菜種植一般采用基地管理，對土壤、灌溉水、肥料中重金屬含量進(jìn)行嚴(yán)格控制密切相關(guān)。

3 結(jié)語

富硒大蒜經(jīng)超聲萃取后，采用液相色譜分離后利用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定樣品中5 種砷的形態(tài)。該方法操作方便，準(zhǔn)確度與精密度均可滿足檢測需要。經(jīng)檢測，市售富硒大蒜中砷的含量普遍較低，主要以低毒性的一甲基砷形態(tài)存在。

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