液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水產(chǎn)品中的微囊藻毒素

吳振興，鮑蕾，趙華梅，靜平，甘南琴

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266000；2.中國科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢430072）

近年來淡水水體富營養(yǎng)化日益加劇，頻繁暴發(fā)藍(lán)藻水華。目前，世界上淡水湖泊藍(lán)藻水華發(fā)生的頻率與嚴(yán)重程度都呈現(xiàn)出迅猛的增長趨勢。在我國，早在20世紀(jì)60年代太湖中就已經(jīng)有藍(lán)藻水華出現(xiàn)[1]。除了云南滇池、江蘇太湖和安徽巢湖三大淡水湖泊已發(fā)生嚴(yán)重的藍(lán)藻水華污染外[2-4]，長江、黃河中下游的許多湖泊和水庫中也都相繼發(fā)生了不同程度的藍(lán)藻水華[5-7]。

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國江蘇省海門市、啟東市和廣西省扶綏縣的原發(fā)肝癌發(fā)病率高與當(dāng)?shù)鼐用耖L期飲用含微量微囊藻毒素的淺塘水或河流水有關(guān)[8]。

微囊藻毒素是一類環(huán)狀七肽化合物，目前發(fā)現(xiàn)有大約60 種異構(gòu)體，在我國富營養(yǎng)化水體中常見的種類為MC-LR 和MC-RR，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。其中MC-RR 最常見，而MC-LR 毒性最大。微囊藻毒素以肝臟為靶器官，能促使腫瘤細(xì)胞的生長，是迄今已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的肝癌促進(jìn)劑，食用含有微囊藻毒素的淡水產(chǎn)品會引起肝臟損傷及肝炎等疾病。

高效液相色譜法（HPLC）是分析微囊藻毒素的常用方法[9]，但是其檢測靈敏度較低，在淡水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測中不能滿足相關(guān)的限量要求。同時由于淡水產(chǎn)品基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)干擾會嚴(yán)重影響高效液相色譜分析的準(zhǔn)確性[10]。固相萃取技術(shù)配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，不僅可以有效去除基質(zhì)干擾，而且具有更高的靈敏度和更強(qiáng)的定性、定量能力。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

超純水。色譜級甲醇、乙腈、甲酸。MC-LR、MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品，Alexis，純度＞95 %。固相萃取小柱，Waters Sep-pakRClassic C18。玻璃纖維濾紙，Whatman GF/F規(guī)格。尼龍針頭過濾器，0.22 μm。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent1200）；串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB API 4000）；旋渦混勻儀（Thermolyne Maxi MixⅡ）；離心機(jī)（Sigma 2-5）；分析天平（Mettler Toledo PL403）；固相提取裝置（Vicam）；氮吹儀（OrganomationN-EVAP111）。色譜柱（Merk LiChroCARTR125-2 RP-18e）。

1.3 方法

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 80%甲醇水溶液，充分振蕩均勻，4 000 r/min 離心10 min，取上清液于新離心管中。殘渣重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，以玻璃纖維濾紙過濾。取6 mL 濾液加入20 mL 水稀釋。待凈化。

1.3.2 凈化

固相萃取小柱使用前依次用10 mL 甲醇和10 mL水活化，流速控制在1～2 滴/s，活化過程中保持萃取小柱始終充滿液體。將提取液全部過柱后，以10 mL 20%甲醇水溶液對C18 固相萃取柱進(jìn)行淋洗，淋洗液全部吹干，最后以10 mL 含有0.1%甲酸的甲醇洗脫微囊藻毒素。

1.3.3 定容

在40 ℃水浴下吹氮濃縮至近干。以25 %甲醇水溶液定容至1 mL，尼龍針頭過濾器過濾后待上機(jī)檢測。

1.3.4 液相色譜參考條件

流動相：A 液，水溶液（含有0.1%甲酸，5 mmol 甲酸銨）；B 液，95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸，5 mmol甲酸銨）。梯度洗脫條件如表1 所示。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.5 質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。離子源電壓：5 500。離子源溫度：650 ℃。霧化氣、氣簾氣、碰撞氣、輔助加熱氣均為高純氮氣，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)如表2 所示。

表2 微囊藻毒素質(zhì)譜檢測多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 2 MRM parameters for microcystins

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)MC-LR、MC-RR 的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧離子源（ESI）多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，得到MC-LR、MC-RR 的分子離子峰，兩種化合物都帶有兩個正電荷，離子質(zhì)量與其所帶電荷的比值即質(zhì)荷比分別為498.4 和519.9。確定分子離子峰后再進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片分析，得到特征子離子信息，根據(jù)其質(zhì)譜圖中的碎片離子選擇豐度相對較高或相對分子量較大的碎片，最后確定特征子離子。MC-LR、MCRR 的二級質(zhì)譜圖如圖1 所示。確定離子對后再對MRM 參數(shù)進(jìn)行自動優(yōu)化。

圖1 MC-LR 和MC-RR 二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS2 spectrum of MC-LR and MC-RR

確定MRM 參數(shù)以后，通過離子源的三通，同時以針泵向質(zhì)譜注入微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品，并以液相向質(zhì)譜注入流動相，進(jìn)行離子源條件的優(yōu)化，最終確定離子源參數(shù)。

2.2 液相條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇

在流動相中加入甲酸，可以提高離子化效率，增加目標(biāo)物的響應(yīng)值；加入緩沖鹽可以提高多目標(biāo)物的分離，改善峰型，還具有去質(zhì)子化的作用，進(jìn)一步增加目標(biāo)物的相應(yīng)值。甲酸銨為揮發(fā)性緩沖鹽，產(chǎn)生氣相離子，不易堵塞管路和針，適用于質(zhì)譜檢測。

比較分析在流動相中加入不同濃度的甲酸和甲酸銨對目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)和分離度的影響，甲酸設(shè)置兩個濃度：0.1 %和0.5 %兩個水平，甲酸銨設(shè)置3 個濃度：2、5、10 mmol/L 3 個水平。同樣的質(zhì)譜條件下檢測1 μg/kg 含量的MC-LR、MC-RR，比較結(jié)果顯示，甲酸濃度0.1%和0.5%兩實驗組沒有明顯差異；甲酸銨濃度5 mmol/L 實驗組目標(biāo)物的響應(yīng)值最高，分離度滿足要求。最終確認(rèn)流動相中添加甲酸濃度為0.1%，甲酸銨濃度為5 mmol/L。

2.2.2 進(jìn)樣量和柱溫的選擇

在檢測MC-LR、MC-RR 的時候增大進(jìn)樣量可以顯著提高目標(biāo)物的響應(yīng)值，但是在檢測樣品的時候，進(jìn)樣量過大會導(dǎo)致峰型變差，峰寬過寬等情況，綜合考慮響應(yīng)值和實際檢測中的基質(zhì)影響，最終確定進(jìn)樣量為10 μL。柱溫設(shè)定30 ℃，保持溫度統(tǒng)一、恒定，以減少溫度變化對儀器檢測環(huán)節(jié)不確定度的影響。

2.2.3 前處理條件的選擇

水產(chǎn)品中微囊藻毒素的提取方法已有相關(guān)報道[11-15]，本實驗參考文獻(xiàn)報道選擇了不同濃度的甲醇溶液作提取溶液，經(jīng)驗證，80%的甲醇溶液具有更好的提取效率，完全可以滿足微囊藻毒素-LR、-RR 的提取要求。為達(dá)到更高的提取效率，一般在樣品提取過程中會采用長時間震蕩等方式。但Smith[16]等的研究指出，在微囊藻毒素的加標(biāo)回收試驗中提取效率隨著提取時間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢，主要原因是微囊藻毒素與樣品中的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽特異性地結(jié)合。基于這種原因，本實驗盡量縮短樣品提取時間，提高提取效率。

固相提取柱可以起到很好的富集、凈化效果。在本研究的初始階段，在以純甲醇作為洗脫液的情況下發(fā)現(xiàn)MC-LR 回收率較好，而MC-RR 的回收率極低。在甲醇中添加0.1%濃度的甲酸后再次進(jìn)行回收率實驗，發(fā)現(xiàn)MC-RR 的回收率顯著改善。分析原因可能為：MC-RR 有著比其他類型微囊藻毒素更高的疏水性，從而回收率較低；此外，在加入甲酸后，酸性環(huán)境促進(jìn)了微囊藻毒素多肽質(zhì)子化，同時甲酸減少了微囊藻毒素與硅膠表面硅醇基之間的相互作用，使其更容易被洗脫下來。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

以質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中的微囊藻毒素存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，本實驗通過減少基質(zhì)成分和采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法來盡可能地降低基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生主要依賴于樣品基質(zhì)，因此，上機(jī)溶液中基質(zhì)成分的含量是影響基質(zhì)效應(yīng)的重要因素之一，在樣品凈化過程中使用固相萃取柱，盡可能地減少提取液中的基質(zhì)成分；在質(zhì)譜檢測環(huán)節(jié)中采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法，空白樣品經(jīng)過前處理后，加入系列濃度待測物標(biāo)準(zhǔn)作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以對檢測結(jié)果進(jìn)行校正。

2.2.5 方法的線性關(guān)系和測定低限

在本測定方法所確定的實驗條件下，分別以蝦、魚空白基質(zhì)提取液配置系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖如圖2 所示。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/kg 以峰面積（Y 軸）對相應(yīng)的微囊藻毒素各組分濃度（X 軸）作圖。

圖2 空白基質(zhì)提取液配置標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrum of blank matrix standards

結(jié)果表明，2 種目標(biāo)物的兩個定量離子對都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系如表3 所示。本方法的測定低限為1.0 μg/kg。

表3 線性關(guān)系Table 3 Linear relationship

2.2.6 方法的回收率和精密度

在0～10.0 μg/kg 的線性范圍內(nèi)，在空白蝦、魚基質(zhì)樣品中添加1.0、5.0、10.0 μg/kg 3 個濃度水平的MCLR 和MC-RR，每個水平做6 個平行樣品，按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品處理和檢測，測得MC-LR 回收率范圍為69.2%～95.6%，MC-RR 回收率范圍為71.6 %～93.1%，變異系數(shù)為3.2%～7.3%。

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