大蒜種質(zhì)超低溫保存及脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

劉曉雪 程智慧

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科（Liliaceae）蔥屬二年生草本植物，營養(yǎng)繁 殖，一般無有性世代，或不能開花結(jié)籽。因此，用鱗芽作種質(zhì)資源保存，需要年年到田間繁殖更新，既占用大量土地資源，耗費(fèi)人力物力，又不利于種質(zhì)穩(wěn)定性的保持。而且，在自然條件下，植株及鱗莖有可能遭受病蟲害的侵襲而喪失種質(zhì)的特性，不 便于種質(zhì)的管理、交換與發(fā)放。

超低溫保存是指在-80℃以下的超低溫環(huán)境中保存種質(zhì)資源，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一套現(xiàn)代生物學(xué)保存技術(shù)（Nag & Street，1973）。常以液氮（-196℃）為冷源，因此超低溫保存又稱液氮保存。近年來，超低溫保存作為一種植物種質(zhì)離體保存新技術(shù)，以其設(shè)備要求簡單，處理步驟相對簡便，效果和重演性好等優(yōu)點(diǎn)，成為種質(zhì)保存研究的熱點(diǎn)（Sakai & Engelmann，2007）。

大蒜在每年的營養(yǎng)繁殖過程中，容易感染病毒并積累在鱗莖中隨 世代傳遞，引發(fā)病毒?。ˋyabe & Sumi，2001）。病毒病易導(dǎo)致大蒜種性退化，鱗莖商品品質(zhì)降低，甚至很多從國外引進(jìn)的新優(yōu)品種，也因病毒侵染種性退化，品質(zhì)降低而再不能用于大蒜商品生產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了 大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

傳統(tǒng)大蒜脫毒方法包括莖尖培養(yǎng)、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)、莖尖二次培養(yǎng)、莖尖微體嫁接、愈傷組織培養(yǎng)等方法。莖尖培養(yǎng)實(shí)際操作難度大；通過愈傷組織途徑分化出芽長成植株也可獲得無毒苗，但是再生植株遺傳變異率較高。與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫法具有植株脫毒率高，操作簡便，再生植株遺傳穩(wěn)定性好，增殖率高且能與超低溫保存種質(zhì)結(jié)合利用等明顯優(yōu)勢 （Wang et al.，2006；Feng et al.，2010）。

1 植物超低溫保存及脫毒原理

1.1 超低溫保存原理

在超低溫條件下，幾乎所有的細(xì)胞代謝活動(dòng)和生長過程都停止，但細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能卻可保存，因而細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性得以保證（Kartha & Engelmann，1994）。超低溫保存原理一般基于以下兩大理論：

① 細(xì)胞冰凍與傷害理論。生物細(xì)胞在降溫過程中只要降溫速率低于脫水的連續(xù)性，細(xì)胞內(nèi)水分就會(huì)不斷向胞外擴(kuò)散，原生質(zhì)體濃縮，從而降低細(xì)胞內(nèi)含物冰點(diǎn)。這種逐漸除去細(xì)胞內(nèi)水分的過程稱為保護(hù)性脫水（Protective dehydration）。但是過度脫水會(huì)使細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)積累，破壞蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)，膜的完整性受到傷害。除此之外，如果胞內(nèi)結(jié)冰，還會(huì)造成機(jī)械傷害（Ice injury）。超低溫保存就是以避免產(chǎn)生這兩種傷害為目的 （王培忠 等，2007）。

② 溶液的玻璃化理論。玻璃化（Vitrification）是指一個(gè)生物物理學(xué)過程——細(xì)胞和溶液在快速降溫時(shí)進(jìn)入一種均一的無定形狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的水不形成冰而進(jìn)入過冷液體狀態(tài)，是一種對細(xì)胞損傷最小的狀態(tài)（Rall & Fahy，1985）。Luyet（1937）認(rèn)為，液體有兩種固 化方式，一是不連續(xù)地固化成晶體；二是連續(xù)固化成非晶體，進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。這時(shí)液體實(shí)際上還是液態(tài)存在形式，且不會(huì)對組織和細(xì)胞造成機(jī)械傷害。植物種質(zhì)超低溫保存成功的關(guān)鍵是要避免細(xì)胞、組織內(nèi)結(jié)冰，使之發(fā)生玻璃化，以安全地貯存。

任何液體只要有足夠的降溫速度都可進(jìn)入玻璃態(tài)。例如要使純水玻璃化，降溫速度需高達(dá)1010℃·s-1，這用常規(guī)的冷卻速度是難以達(dá)到的。通過添加高濃度的冰凍保護(hù)劑可以顯著降低液體進(jìn)入玻璃態(tài)所需的降溫速度（李廣武，1998），促進(jìn)保存材料組織在結(jié)冰早期進(jìn)行保護(hù)性脫水，阻止冰晶生長，從而使之較易達(dá)到玻璃化狀態(tài)。

1.2 超低溫脫毒原理

利用超低溫方法脫毒的材料多為植物莖尖。Feng 等（2010）認(rèn)為供試莖尖經(jīng)超低溫凍存后，其最頂端以及第1、2 葉原基由于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)體積比例大，內(nèi)含物質(zhì)濃度高，細(xì)胞內(nèi)空泡少且維管組織發(fā)育不全，因此能夠經(jīng)受住低溫而存活下來。而這部分組織病原物含量較少甚至不含病原物。與此同時(shí)莖尖下部其余部分因細(xì)胞較成熟，水分含量多而易被凍死，這部分組織多含有大量病原物。最終，經(jīng)過超低溫處理，含有病原物的組織凍傷壞死，而不含病原物的組織存活下來，繼續(xù)分裂分化形成脫毒植株。

2 大蒜種質(zhì)超低溫保存研究現(xiàn)狀

超低溫作為種質(zhì)保存和脫毒的一種新方法，已經(jīng)應(yīng)用于多種植物上，包括馬鈴薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Pennycooke & Towill，2000；Feng et al.，2010）、百合（Chen et al.，2011）、菊花（Hitmi et al.，1997；Halmagyi et al.，2004）、蘋果（Paul et al.，2000）等。大蒜超低溫研究多集中在超低溫保存體系的建立上。

超低溫保存按其降溫冰凍方式不同，有多種不同方法，包括早期的慢速冰凍法、快速冰凍法、分步降溫法、干燥冰凍法等，以及目前多采用的玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法（馬千全 等，2007；吳昀 等，2012）。已有的研究采用的大蒜材料主要是鱗芽莖尖，也有報(bào)道用氣生鱗莖和未成熟花序作為外植體材料。所采用的超低溫方法以基于玻璃化的玻璃化法和小滴玻璃化法為主，尚未見其他超低溫方法用于大蒜種質(zhì)保存的報(bào)道。

2.1 超低溫保存材料的選擇

由于超低溫保存對材料降溫速率的特殊要求，因此所選材料需具有體積小、再生能力強(qiáng)且分化程度低的特征，一般選擇莖尖分生組織作為超低溫保存材料。

對大蒜的超低溫保存而言，傳統(tǒng)且常見的保存材料為大蒜鱗芽莖尖（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2006，2007；王 艷 軍 等，2005；徐 培 文 等，2005）。Baek 等（2003）對大蒜莖尖進(jìn)行了超低溫保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外植體來源與大小對凍后材料的存活率及再生率都有很大影響。在最適條件下，莖尖再生率可達(dá)90%以上。另有報(bào)道采用玻璃化法凍存大蒜胚性愈傷組織，最高存活率為30%（Sudarmonowati，2001）。但因這種材料凍后存活率低且遺傳穩(wěn)定性較差，一直未得到普遍采用。

近年來，國外學(xué)者開始嘗試采用大蒜其他材料進(jìn)行超低溫保存。Kim 等（2007）比較了大蒜鱗莖莖尖、未成熟花序、成熟的氣生鱗莖及獨(dú)頭蒜莖尖等材料的超低溫保存效果，認(rèn)為未成熟花序具有污染率低、凍后幼苗成苗快等優(yōu)點(diǎn)。Makowska 等（1999）比較研究了鱗芽莖尖和氣生鱗莖兩種材料的超低溫保存效果，表明鱗芽莖尖存活率和再生率均高于氣生鱗莖，但氣生鱗莖凍后一致性好且污染率低。Keller 等（2010）又以大蒜未成熟花序基部為材料進(jìn)行超低溫保存，認(rèn)為未成熟花序基部具有直接取材、無需離體擴(kuò)繁、污染率低等優(yōu)點(diǎn)。

雖然目前鱗芽莖尖仍被研究者廣泛用于大蒜超低溫保存，但其莖尖剝?nèi)∮幸欢y度，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此不便于大蒜超低溫技術(shù)的推廣應(yīng)用。采用氣生鱗莖作材料，盡管一致性好，污染率低，但凍后存活率和再生率較低是其最大缺陷。而未成熟花序基部作為超低溫保存材料，不僅具有操作容易、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有較高存活率和再生率，是大蒜超低溫保存極具應(yīng)用潛力的新型材料。

2.2 超低溫保存方法的選擇

目前植物超低溫保存方法以玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法為主。在大蒜超低溫保存中，玻璃化法研究最多（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2007；Volk et al.，2004；王艷軍 等，2005；Ellis et al.，2006；Keller et al.，2010），但Keller等（2010）研究證明小滴玻璃化法保存大蒜莖尖，其存活率、再生率均高于玻璃化法。Kim 等（2006）利用小滴玻璃化法保存大蒜莖尖，再生率可達(dá)77.4%～95.4%。

相較于傳統(tǒng)的玻璃化法，小滴玻璃化法適用于對脫水及冷刺激較不敏感的植物材料，且具有降溫速率快、凍后成活率高等優(yōu)點(diǎn)，是適于大蒜種質(zhì)超低溫保存的一種方法。

2.3 玻璃化溶液的選擇

在植物超低溫保存研究中，常用的玻璃化 溶液，即PVS（Plant Vitrification Solution）主要有3種：PVS2〔30% 甘油+15% 乙二醇+15% 二甲亞砜（DMSO）+0.4 mol·L-1蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基〕、PVS3（50% 甘油+50% 蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基）和PVS4（35% 甘油+20% 乙二醇+0.6 mol·L-1蔗糖+MS 液體培養(yǎng)基）（Sakai & Engelmann，2007）。其中，PVS2 和PVS3 在大蒜中應(yīng)用最普遍。

Kim 等（2004）研究表明，PVS3 是保存大蒜最有效的玻璃化溶液，用PVS3處理150～180 min，大蒜再生率可達(dá)92%。Makowska 等（1999）研究證明使用PVS3 溶液保存大蒜效果優(yōu)于PVS2。Keller 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，PVS3 確實(shí)對大蒜超低溫保存具有良好效果，PVS4 則沒有效果，不能用于大蒜超低溫保存。Ellis 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)PVS2 和PVS3 保存大蒜種質(zhì)效果無明顯差異。

PVS3 與PVS2 相比，不含二甲亞砜和乙二醇兩種成分，雖然脫水效果不如PVS2，但對材料的毒害作用較小。因此，在大蒜超低溫保存中，較為理想的玻璃化溶液是PVS3。

2.4 影響超低溫保存效果的因素

超低溫保存植物研究中，植物凍后存活率和再生率不僅與超低溫體系各個(gè)步驟的優(yōu)化有關(guān)，還會(huì)受植物基因型的影響。同種植物不同基因型和品種，其超低溫保存效果往往差異很大。

Volk 等（2004）利用AFLP 標(biāo)記區(qū)別出不同基因型的美國大蒜資源用于超低溫保存試驗(yàn)，以研究大蒜不同基因型對超低溫凍存的反應(yīng)。結(jié)果雖然不同基因型之間存活率和再生率差異顯著，但將超低溫應(yīng)用于不同基因型的大蒜資源保存是可行的。

王艷軍等（2005）用山東蒼山大蒜進(jìn)行了超低溫保存研究，存活率最高達(dá)到100%。Kim 等（2004）超低溫保存了10個(gè)大蒜品種，再生率為72%～95%。Kim 等（2007）超低溫保存韓國大蒜品種超過930個(gè)，平均存活率79.9%，再生率78.2%。在大蒜超低溫保存體系研究中，目前還沒有一個(gè)廣泛適用于大蒜 各種基因型的完整體系。

除材料基因型對超低溫保存效果有很大影響以外，其田間生長過程中的生理狀態(tài)以及采收后保存等條件也是重要影響因素。

英國Lynch 等（2010）認(rèn)為大蒜超低溫保存的重點(diǎn)在于確定各大蒜品種在生長季節(jié)和超低溫保存后再生長的生理變化。因?yàn)槭斋@后貯存體系和貯存時(shí)間影響組織培養(yǎng)條件下大蒜材料的反應(yīng)。Kim 等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，采后貯藏3個(gè)月或6個(gè)月后再進(jìn)行超低溫保存的大蒜再生率最高。

總之，影響大蒜超低溫保存效果的因素紛繁復(fù)雜，還需要進(jìn)行大量的研究工作才能闡明其中的規(guī)律，探索出一條能夠廣泛用于大蒜超低溫保存的完整體系。

3 大蒜脫毒研究

我國及世界大蒜主產(chǎn)區(qū)的主栽大蒜品種和品系往往受多種病毒復(fù)合侵染，洋蔥黃矮病毒（OYDV）、韭蔥黃條斑病毒（LYSV）和洋蔥螨傳潛隱病毒（OMBFV）是主要病毒種類。青蔥潛隱病毒（SLV）、大蒜普通潛隱病毒（GCLV）和馬鈴薯Y 病毒組的侵染率較低，其發(fā)病程度與地區(qū)緯度有關(guān)，可能受栽培地區(qū)的氣溫、光照條件及毒源的影響（徐培文 等，1999）。

早在1973年Havránek（1973）通過培養(yǎng)0.4～0.5 mm 莖尖獲得脫除大蒜花葉病毒（GMV）的植株以來，世界各國研究者進(jìn)行了很多大蒜脫毒方面的研究。目前常用技術(shù)主要有：莖尖培養(yǎng)、溫?zé)崽幚?、花序軸離體培養(yǎng)、莖盤培養(yǎng)及莖盤圓頂結(jié)構(gòu)培養(yǎng)等（趙心愛和薛慶中，2002）。

3.1 脫毒材料

大蒜脫毒傳統(tǒng)材料為莖尖分生組織，Sant 等（1982）用0.4～0.9 mm 莖尖培養(yǎng)獲得了脫毒大蒜植株。Walkey 等（1987）以莖尖分生組織為材料培養(yǎng)獲得大蒜，脫毒率為25%～50%。Martin 等（1995）用ELISA 檢測出4種大蒜病毒，并以莖尖為材料培養(yǎng)獲得對不同病毒的脫毒效果：大蒜普通潛隱病毒脫毒率62%，韭蔥黃條斑病毒脫毒率100%，洋蔥黃矮病毒脫毒率92%，洋蔥螨傳潛隱病毒脫毒率54%以下。研究還發(fā)現(xiàn)，用于脫毒的莖尖分生組織越小，脫毒效果越好，但材料＜0.4 mm時(shí)無法再生。Bertaccini 等（2004）以莖尖分生組織為材料進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，RT-PCR檢測結(jié)果表明對大蒜螨傳病毒的脫毒率為27%。

由于以莖尖分生組織為材料進(jìn)行脫毒培養(yǎng)對材料大小要求嚴(yán)格，莖尖較小操作起來較為困難且脫毒率較低。因此有研究者開始采用大蒜其他部位的材料進(jìn)行脫毒研究。

Wang 等（1994）以大蒜花莖頂端為材料進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，脫毒率為77.6%，高于含3個(gè)葉原基的莖尖培養(yǎng)（26.5%）和含1～2個(gè)葉原基的莖尖培養(yǎng)（45.4%）。Ayabe 和Sumi（2001）以大蒜莖盤為材料進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，RT-PCR 和免疫組織印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中病毒被脫除；電鏡觀察不同發(fā)育階段組織表明，脫毒可能與維管束結(jié)構(gòu)階段發(fā)育有關(guān)。Haque 等（2007）以2～3 mm 大蒜根尖分生組織為材料進(jìn)行脫毒研究，經(jīng)RT-PCR檢測：根尖分生組織培養(yǎng)能夠有效脫除大蒜主要病毒，是可用于大蒜脫毒的一種高效新型材料。

3.2 脫毒方法

目前大蒜脫毒常用的方法主要是基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的莖尖培養(yǎng)，也有莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理進(jìn)行脫毒的報(bào)道，化學(xué)處理脫毒效果較差。

Walkey 等（1987）研究發(fā)現(xiàn)，若在組織培養(yǎng)前將材料進(jìn)行38℃處理，可使脫毒率從25%提高到85%。Ramírez-Malagón 等（2006）比較了溫?zé)崽幚?、化學(xué)處理和分生組織培養(yǎng)對Taiwan和Chileno 兩個(gè)大蒜品種的脫毒效果，脫毒率溫?zé)崽幚矸謩e為63% 和70.9%，化學(xué)處理分別為27%和34.8%，分生組織培養(yǎng)均為64%。

3.3 脫毒苗的應(yīng)用

大蒜脫毒研究主要集中于脫毒材料及方法的選擇，脫毒試管苗繁育及田間表現(xiàn)的研究報(bào)道較少。Xu 等（1994）優(yōu)化了大蒜莖尖培養(yǎng)脫毒試管苗及移栽田間后的管理，并使用氣生鱗莖進(jìn)行無毒苗擴(kuò)繁，提高了大蒜脫毒苗的增殖系數(shù)，為脫毒苗的生產(chǎn)應(yīng)用提供了依據(jù)。

3.4 超低溫處理與大蒜脫毒

與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫處理具有植株脫毒率高、操作簡便、再生植株遺傳穩(wěn)定性好且增殖率高等明顯優(yōu)勢，同時(shí)能與超低溫保存種質(zhì)相結(jié)合，既保存了種質(zhì)又能獲得無毒種苗（Wang et al.，2006）。目前，超低溫脫毒技術(shù)在很多植物上都有應(yīng)用，包 括黃瓜（Helliot et al.，2002）、葡萄（Wang et al.，2003）、馬鈴薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Feng et al.，2010）、香蕉及一些果樹砧木（Brison et al.，1997）等的脫毒。Wang 等（2006）研究表明：馬鈴薯經(jīng)超低溫脫毒后，馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）和馬鈴薯Y 病毒（PVY）的脫毒率分別可達(dá)83%～86%和91%～95%，高于分生組織培養(yǎng)（56% 和62%）和溫?zé)崽幚砻摱荆?0% 和 65%），與溫?zé)崽幚斫Y(jié)合分生組織脫毒率相近（90%和93%）。證明超低溫處理作為脫毒的新方法，不僅脫毒效率高且操作簡便。

目前國內(nèi)外對大蒜脫毒方法及其效果的研究多采用莖尖分生組織培養(yǎng)、溫?zé)崽幚?、莖盤培養(yǎng)和花莖頂端培養(yǎng)等傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法。應(yīng)用超低溫處理進(jìn)行大蒜脫毒研究的相關(guān)報(bào)道很少，目前僅有韓國Kim 等（2007）用RT-PCR檢測表明，一些被病毒感染的大蒜材料經(jīng)超低溫保存后再生的幼苗病毒量減少，而系統(tǒng)的研究尚未見報(bào)道。

4 存在問題與展望

超低溫技術(shù)作為一項(xiàng)大蒜種質(zhì)資源保存及脫毒的新技術(shù)，盡管有著顯而易見的優(yōu)勢，但由于其研究起步較晚，加之很多內(nèi)在機(jī)理尚未揭示，至今仍有很多亟待解決的問題。

4.1 取材方面

在現(xiàn)有的大蒜超低溫研究中主要材料為大蒜莖尖。而這種材料存在一定問題。首先是材料不足，大蒜莖尖可供切取的數(shù)目有限，往往不能滿足超低溫保存的要求，而且從鱗芽中剝?nèi)∏o尖操作難度也較大；其次是材料來源，鱗芽來源于土壤，土壤環(huán)境比較復(fù)雜，導(dǎo)致所取材料極有可能沾染一些病原物，如細(xì)菌、真菌、病毒和昆蟲類。這給隨后的組織培養(yǎng)帶來了一定困難：如果消毒不徹底，帶菌材料的存活率會(huì)受到影響，從而影響超低溫保存的效率；消毒過度又會(huì)引起材料的損傷，同樣也對材料存活率有不利影響。

已有研究開始嘗試將大蒜氣生鱗莖、未成熟花序等材料用于超低溫保存。此外，還可通過莖盤或花序軸誘導(dǎo)生成大蒜不定芽或側(cè)芽，既解決了材料少的問題，又降低了莖尖剝?nèi)〉碾y度，提高了效率。同時(shí)由于不定芽體系在離體無菌條件下建立，因此可排除病原物的干擾，降低試材污染率。隨后的研究可以在取材方面進(jìn)行進(jìn)一步的探索，如蒜薹頂端分生組織——花序軸也可用于超低溫保存，以及如何提高大蒜不定芽的增殖系數(shù)等。

4.2 遺傳穩(wěn)定性檢測方面

現(xiàn)有研究中對大蒜超低溫凍存后材料的遺傳穩(wěn)定性檢測雖有涉及，但研究都不系統(tǒng)。而且普遍采用的檢測方法多側(cè)重于分子、染色體等微觀層面。因此對試材再生后田間種植的植株表現(xiàn)及生態(tài) 適應(yīng)性等宏觀表型因素需要進(jìn)一步分析，以明確超低溫凍存對大蒜生理生態(tài)方面產(chǎn)生的效應(yīng)。

4.3 超低溫脫毒方面

目前大蒜超低溫研究多集中于對超低溫保存程序的建立和優(yōu)化。大蒜病毒病是生產(chǎn)上急需解決的問題之一。因此，需進(jìn)行超低溫脫除大蒜主要病毒的研究，為繁育大蒜脫毒苗，保持優(yōu)良品種種性，解決實(shí)際生產(chǎn)問題開辟新的途徑。

4.4 超低溫保存體系優(yōu)化方面

大蒜超低溫保存程序根據(jù)其品種的不同，同一品種取材部位的不同，乃至所選用的超低溫凍存方法的不同而存在很大差異，且經(jīng)凍存后大蒜的存活率和再生率結(jié)果差異也較大。目前尚未建立起具有廣泛適用性的大蒜超低溫保存體系。

因此，在今后的研究中，應(yīng)著力研發(fā)廣泛適用于不同大蒜品種，且具有穩(wěn)定存活率和再生率的超低溫保存體系，為該項(xiàng)技術(shù)投入生產(chǎn)實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

此外，大蒜超低溫保存過程中的組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化尚未見報(bào)道。超低溫凍存過程涉及一系列細(xì)胞凍融的物理化學(xué)變化，這些變化勢必會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面的變化。

研究這些細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)變化對于深入了解超低溫保存技術(shù)的實(shí)質(zhì)，揭示其內(nèi)在規(guī)律，從而有目的地優(yōu)化大蒜超低溫保存體系有重要意義。在以后的研究中，可通過掃描電鏡、透射電鏡、光譜分析法、差熱分析法及核磁共振等方法進(jìn)行此類問題的探索。

李廣武.1998.低溫生物學(xué).長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社.

馬千全，徐 立，李志英，李克烈.2007.植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)研究進(jìn)展.熱帶作物學(xué)報(bào)，28（1）：105-110.

王培忠，裴崎君，顧寒琳，韓國輝，姜維軍，姜成欣，李紹臣.2007.植物種質(zhì)資源超低溫保存原理與研究進(jìn)展.吉林林業(yè)科技，36（4）：17-20.

王艷軍，李錫香，向長萍，沈鏑，宋江萍.2005.大蒜莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)研究.園藝學(xué)報(bào)，32（3）：507-509.

吳昀，張琳，林田，夏宜平.2012.超低溫保存植物種質(zhì)資源的新途徑——小滴玻璃化法.植物生理學(xué)報(bào)，48（5）：511-517.

徐培文，劉憲華，高主太，曲士松，楊崇良，尚佑芬，趙玖華，劉恒英.1999.中國大蒜種質(zhì)資源研究——主要大蒜品種和品系的病毒檢測//中國園藝學(xué)會(huì).中國園藝學(xué)會(huì)成立70 周年紀(jì)念優(yōu)秀論文選編.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社：359-362.

徐培文，劉冰江，曲士松.2005.大蒜種質(zhì)創(chuàng)新和育種研究進(jìn)展.中國園藝學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì).長沙.

趙心愛，薛慶中.2002.檢測大蒜病毒和產(chǎn)生脫毒蒜的方法.植物生理學(xué)通訊，38（6）：603-606.

Ayabe M，Sumi S.2001.A novel and efficient tissue culture method-‘stem-disc dome culture’-for producing virus-free garlic （Allium sativumL.）.Plant Cell Rep，20：503–507.

Baek H J，Kim H H，Cho E G，Chae Y A，Engelmann F.2003.Importance of explant size and or igin and of preconditioning treatments for cryopreservation of garlic shoot apices by vitrification.Cryoletters，24：381-388.

Bertaccini A，Botti S，Tabanelli D，Dradi G，F(xiàn)ogher C，Previati A，Da R F.2004.Micropropagation and establishment of miteborne virus-free garlic （Allium sativum）.ISHS Acta Hort 631：XXVI International Horticultural Congress：Issues and Advances in Transplant Production and Stand Establishment Research.

Brison M，de Boucaud M T，Pierronnet A，Dosba F.1997.Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv.Prunusrootstock e xperimentally infected withPlum pox potyvirus.Plant Sci，123：189-196.

Chen X L，Li J H，Xin X，Zhang Z E，Xin P P，Lu X X.2011.Cryopreservation ofin vitro-grown apical meristems ofLiliumby droplet-vitrification.South African Journal of Botany，77：397-403.

Ellis D，Skogerboe D，Andre C，Hellier B，Volk G.2006.Implementation of garlic cryopreservation techniques in the national plant germplasm system.Cryoletters，27（2）：99-106.

Feng C，Yin Z，Ma Y，Zhang Z，Chen L，Wang B，Li B，Huang Y，Wang Q C.2010.Cryopreservation of sweetpotato （Ipomoea batatas） and its pathogen eradication by cryotherapy.Biotechnol Adv，29：84-93.

Halmagyi A，F(xiàn)ischer-Klüver G，Mix-Wagner G，Schumacher H M.2004.Cryopreservation ofChrysanthemum morifolium（DendranthemagrandifloraRamat.）using different approaches.Plant Cell Rep，22：371-375.

Haque S，Hattori K，Suzuki A，Tsuneyoshi T.2007.An efficient novel method of producing virus free plants from garlic root meristem.Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond，part2：107-110.

Havránek，P.1973.Occurrence of viruses in the genusAlliumand virus-free clones of common garlic （Allium sativum）.Proc 7th Conf Czechoslovak Plant Virologists.Bratislava：Publishing House of the Slovak Acad of Sciences：133-138.

Helliot B，Panis B，Poumay Y，Swennen R，Lepoivre P，F(xiàn)rison E.2002.Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaic and bananastreak viruses from banana （Musaspp.）.Plant Cell Rep，20：1117-1122.

Hitmi A，Sallanon H，Barthomeuf C.1997.Cryopreservation ofChrysanthemum cinerariaefoliumVis.cells and its impact on their pyrethrin biosynthesis ability.Plant Cell Rep，17：60-64.

Kartha K K，Engelmann F.1994.Cryopreservation and germplasm storage.Canada：Kluwer Acadcmic Publisher：195-230.

Keller J，Kotlinska T，Reis A.2010.Cryopreservat ion of young inflorescence bases in bolting garlic for germplasm storage.Bioversity International，AEGIS Project：1-40.

Kim H H，Cho E G，Baek H J，Kim C Y，Keller E R J，Engelmann F.2004.Cryopreservation of garlic shoot tips by vitrification：effects of dehydration，rewarming，unloading and regrowth conditions.Cryoletters，25：59-70.

Kim H H，Lee J K，Yoon J W，Ji J J，Nam S S，Hwang H S，Cho E G，Engelmann F.2006.Cryopreservation of garlic bulbil primordia by the droplet-vitrification procedure.Cryoletters，27：143-153.

Kim H H，Lee J K，Hwang H S.2007.Cryopreservation of garlic germplasm collections using the droplet-vitrification technique.Cryoletters，6：471-482.

Luyet B J.1937.The vitrification of organie colloids and of protoplasm.Biodynamica，29：1-14.

Lynch P T，Souch G R，Harding K.2010.Effects of post-harvest quality and storage on the cryopreservation ofAllium sativumin vitrocultures by encapsulation/dehydration.Crybiol，61：362-408.

Makowska Z，Keller J，Engelmann F.1999.Cryopreservation of apices isolated from garlic （Allium sativumL.） bulbils and cloves.Cryoletters，20：175-182.

Martin V，Paul D，Peter M W.1995.Efficiency of eradication of four viruses from garlic （Allium sativum） by meristem-tip culture.European Journal of Plant Pathology，101：231-239.

Nag K K，Street H E.1973.Carrot embryogenesis from frozen cultured cells.Nature，245：270-272.

Paul H，Daigny G，Sangwan-Norreel B S.2000.Cryopreservation of apple（Malus×domesticaBorkh.）shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulation-vitrification.Plant Cell Rep，19：768-774.

Pennycooke J C，Towill L E.2000.Cryopreservation of shoot tips fromin vitroplants of sweet potato〔Ipomoea batatas（L.）Lam.〕by vitrification.Plant Cell Rep，19：733-737.

Rall W F，F(xiàn)ahy G M.1985.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification.Nature，313：573-575.

Ramírez-Malagón R，Pérez-Moreno L，Borodanenko A，Salinas-González G J，Ochoa-Alejo N.2006.Differential organ infection studies，potyvirus elimination，and field performance of virus-free garlic plants produced by tissue culture.Plant Cell Tiss Organ Cult，86：103-110.

Sakai A，Engelmann F.2007.Vitrification，encapsulation-vitrification and droplet-vitrification：a review.Cryoletters，28（3）：151-172.

Sant S B，Daniel C，Peter R F.1982.Production of virus-free garlic and field performance of micropropagated plants.Scientia Horticulturae，18：39-43.

Sudarmonowati E.2001.Cryopreservation of garlic （Allium sativum） cv.Lumbu Hijau using vitrification technique.Annales Bogorienses n.s.，8（1）：39-47.

Volk G M.，Maness N，Rotindo K.2004.Cryopreservation of garlic（Allium sativumL.） using plant vitrification solution 2.Cryoletters，25：219-226.

Walkey D G，Webb J.W.Bolland C J，Miller A.1987.Production of virus-free garlic（Allium sativumL.） and shallot （A.ascalonicumL.） by meristem-tip culture.Journal of Horticultural Science，62（2）：211-220.

Wang H L，Ma Y，Zhang C J，Kang Y Q.1994.High rate of virus-free plantlet regeneration via garlic scape-tip culture.Plant Cell Rep，14：65-68.

Wang Q，Mawassi M，Li P，Gafny R，Sela I，Tanne E.2003.Elimination ofGrapevine virus A（GVA） by cryopreservation ofin vitro-grown shoot tips ofVitis viniferaL..Plant Sci，165：321-327.

Wang Q C，Liu Y，Xie Y H，You M.2006.Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination ofPotato leafroll virus（PLRV）andPotato virus Y（PVY）.Potato Research，49：119-129.

Xu P W，Sun H S，Sun R J，Yang Y J.1994.Strategy for the use of virus-free seed garlic in field production.Acta Horticulturae，358：307-311.