高靜壓處理對花生蛋白的改性研究

周婷婷，呂茜，張玉玉，宋弋，李娟，楊瑞學(xué)，李全宏，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.中國農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京100083）

花生蛋白質(zhì)主要由花生球蛋白和伴花生球蛋白組成，其中花生球蛋白占63%，伴花生球蛋白占33%，是一種高營養(yǎng)的植物蛋白資源[1]?；ㄉ鞍讘?yīng)用于食品行業(yè)，最重要的方面是利用其功能性質(zhì)。花生蛋白的功能特性是指花生蛋白在加工、處理、貯藏制備和消費(fèi)過程中影響蛋白質(zhì)在食品體系中應(yīng)用的某些物理、化學(xué)特性的總稱[2]，包括溶解性、乳化性、發(fā)泡性等。然而天然花生蛋白的功能性質(zhì)無法滿足食品加工的需要，因此，對花生蛋白深度的開發(fā)離不開花生蛋白改性的研究。

高靜壓技術(shù)（High Hydrostatic Pressure，HHP），是能改善食品功能性質(zhì)的一種新型食品加工技術(shù)。高壓加工可引起蛋白質(zhì)等生物高聚物結(jié)構(gòu)和反應(yīng)活性的復(fù)雜變化，但對食品的營養(yǎng)物質(zhì)、天然風(fēng)味和色澤的破壞極小，從而可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的產(chǎn)品[3]。目前超高壓對蛋白的改性研究主要集中于大豆蛋白[4-5]，對花生蛋白的改性研究較少。

本文以花生分離蛋白及花生蛋白中含量較多的組分花生球蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，研究了高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白的溶解性、乳化性、表面疏水性 巰基含量等性質(zhì)的影響，為花生蛋白的深度加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫冷榨花生粕（市售），粉碎后過60 目篩，水分7.4%，蛋白質(zhì)40.4%，灰分4.49%；大豆精制油：福臨門有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

TGL-16A 臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙平凡儀器儀表有限公司；2802 紫外可見分光光度計(jì)尤尼科：上海儀器有限公司；Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)：美國Varian 公司；HHP-650 高靜壓設(shè)備：包頭科發(fā)高壓科技有限公司；LGJ-12 冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技公司；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白、花生球蛋白的制備

將低溫冷榨花生粕粉碎過60 目篩，與正己烷以1 ∶5 體積比混合，室溫下連續(xù)攪拌脫脂1 h，靜置沉降分層，傾出有機(jī)溶劑后重復(fù)上述步驟，室溫下通風(fēng)干燥12 h 得脫脂花生粉。

采用堿溶酸沉法[6]提取花生分離蛋白，取脫脂花生粉，按1 ∶9（質(zhì)量比）比例加水后升溫至60 ℃，在攪拌條件下用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至9.0，浸提1.5 h，離心后取沉淀進(jìn)行二次提取，合并上清液，用鹽酸調(diào)整pH 至4.5，離心取沉淀，中和pH 至7.0，透析，冷凍干燥得花生分離蛋白（PPI）。

花生球蛋白的提取參照文獻(xiàn)[7]的等電點(diǎn)沉淀法，將5 g 脫脂花生粉加入0.03 mol/L Tris-HCl（pH8.5）緩沖液中，45 ℃攪拌提取1 h，9 000 r/min 冷凍離心30 min，取沉淀以相同條件進(jìn)行二次提取，合并兩次上清液，加入亞硫酸氫鈉至0.01 mol/L，調(diào)pH 至6.4，4 ℃冷沉過夜。6 500 r/min 4 ℃離心20 min，將沉淀溶解，中和pH 至7.0，透析，冷凍干燥得花生球蛋白。

1.3.2 蛋白溶液的高靜壓處理

將2 g 花生分離蛋白、花生球蛋白分別溶解于0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖液中，調(diào)節(jié)pH 至7.5。室溫下攪拌30 min，使蛋白充分溶解。然后將蛋白溶液真空密封于聚乙烯塑料袋中（不留氣泡），放于壓力容器內(nèi)腔，并浸沒于傳壓介質(zhì)中，進(jìn)行高靜壓處理，設(shè)定壓力水平分別為（300±10）、（400±10）、（500±10）、（600±10）MPa，常溫保壓20 min。壓力處理后的樣品冷凍干燥處理，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 蛋白溶液的配制

取適量冷凍干燥的未處理和超高壓處理過的花生分離蛋白、花生球蛋白粉分別溶于0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖液中，調(diào)節(jié)pH 至7.5，室溫下攪拌30 min，使蛋白充分溶解。

1.3.4 蛋白質(zhì)溶解性測定

取適量蛋白溶液于10 000 r/min，4 ℃下離心10 min，以福林-酚法[8]測定上清及總蛋白含量。蛋白質(zhì)的氮溶指數(shù)NSI（%）按下式計(jì)算：

1.3.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定方法[9]

使用5 mL 大豆精制油和15 mL 蛋白溶液制備乳狀液，在高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì)，10 000 r/min 處理5 min，而后迅速從乳狀液底部取出50 μL 乳濁液，用5 mL 0.1%SDS 溶液稀釋，在微型旋渦混合儀上混勻后取少量稀釋樣品于500 nm 下測定吸光度A0。10 min后再取50 μL 樣品用5 mL 0.1%的SDS 溶液稀釋，并測定500 nm 處吸光度A10。乳化性和乳化穩(wěn)定性分別用EAI 和ESI 表示。

式中：C 為蛋白濃度，（g/mL）；T=2.303；φ=0.25；稀釋倍數(shù)為1 000。

1.3.6 蛋白質(zhì)表面疏水性測定

表面疏水性采用ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）熒光探針法進(jìn)行測定[10]。使用0.03 mol/L pH7.5Tris-HCl 緩沖液將兩種花生蛋白溶液的蛋白濃度分別稀釋至0.05 mg/mL～0.8 mg/mL。取不同濃度稀釋樣品2 mL，在390 nm 的激發(fā)波長和470 nm 的發(fā)射波長下分別測定樣品的熒光強(qiáng)度（FI0）和樣品加入10 μL ANS 溶液（8 mmol/L）后的熒光強(qiáng)度（FI1），F(xiàn)I1和FI0的差值記為FI，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I 為縱坐標(biāo)作圖，曲線的初始階段的斜率即蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)，記為S0。相對表面疏水性指數(shù)RS0（%）計(jì)算公式如下：

式中：S0C為未處理樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.3.7 游離巰基含量的測定[11]

取未處理和超高壓處理過的花生蛋白溶液0.5 mL，加入4.5 mLTris-甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=8.0，含0.01 mol/L EDTA），混勻后于40 ℃恒溫水浴中保溫30 min，然后加入125 μL Ellman 試劑，混勻后于20 ℃恒溫水浴中保溫 ，用紫外分光光度計(jì)在波長下測定吸光值A(chǔ)412。游離巰基含量可通過下式計(jì)算得出：

式中：D 為稀釋倍數(shù)；13600 為摩爾吸光系數(shù)，[L/（mol·cm）]；C 為樣品中蛋白質(zhì)含量，（mg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白溶解性的影響

超高壓處理可以破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、靜電相互作用和疏水作用等非共價(jià)鍵作用，從而影響蛋白質(zhì)的水合性質(zhì)，使得溶解度發(fā)生變化[12]。高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白溶解性的影響，見圖1、圖2。

圖1 高靜壓處理對花生分離蛋白溶解性的影響Fig.1 The effect of HHP on solubility of PPI

圖2 高靜壓處理對花生球蛋白溶解性的影響Fig.2 The effect of HHP on solubility of peanut globulins

由圖1、圖2 可知，高靜壓處理對花生分離蛋白和花生球蛋白的溶解度產(chǎn)生了顯著影響，兩者氮溶指數(shù)的最高值分別比未處理蛋白的提高了約3.5 倍和1倍，但花生分離蛋白和花生球蛋白的溶解性變化趨勢略有不同。在0.1 MPa～400 MPa 范圍內(nèi)，兩種蛋白質(zhì)的溶解度均隨著壓力升高而變大，且花生球蛋白的溶解度在400 MPa 時達(dá)到最大值，在此范圍內(nèi)超高壓處理使凝聚球狀蛋白質(zhì)松散和伸展，與水作用的極性基團(tuán)或離子基團(tuán)增多，蛋白水化增強(qiáng)，使蛋白溶解性增大。400 MPa～600 MPa 范圍內(nèi)花生分離蛋白的溶解度先增大后減少，在 處達(dá)到最大，花生球蛋白的溶解性則隨著壓力的增大而減少，在較高壓力下，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)和巰基暴露出來，形成不可溶聚集體，從而使蛋白質(zhì)的溶解度下降。由于兩者的蛋白組成、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同，溶解度從而呈現(xiàn)出不同的趨勢。

2.2 高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響，見圖3、圖4。

圖3 高靜壓處理對花生分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of HHP on emulsifying activity and stability of PPI

圖4 高靜壓處理對花生球蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of HHP on emulsifying activity and stability of Peanut globulins

由圖3、圖4 可以看出，高靜壓處理對花生分離蛋白和花生球蛋白的乳化性產(chǎn)生了顯著影響，兩者乳化性指數(shù)的最高值分別比未處理蛋白的提高了1.5 倍和4 倍，但花生分離蛋白和花生球蛋白的乳化性變化趨勢略有不同，乳化穩(wěn)定性均呈下降趨勢。在0.1 MPa～400 MPa 范圍內(nèi)，兩種蛋白質(zhì)的乳化性均隨著壓力升高而變大，且花生分離蛋白的乳化性在400 MPa 時達(dá)到最大值，在此范圍內(nèi)蛋白經(jīng)超高壓處理后，分子伸展，與水作用的極性基團(tuán)或離子基團(tuán)增多，親水性增加；另一方面，超高壓也會使蛋白分子內(nèi)部的疏水基暴露出來，親油性增加，兩者達(dá)到較好的平衡，乳化性能得到提高[13]?；ㄉ蛛x蛋白的乳化性則隨著壓力的增大而減少，其原因在于兩者組成不同，降低油-水界面表面張力的能力大小有所區(qū)別，當(dāng)?shù)鞍资艿降膲毫^大時，親油 親水的平衡被打破，蛋白質(zhì)的乳化性能則下降。

2.3 高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白表面疏水性的影響

高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白表面疏水性的影響，見圖5、圖6。

圖5 高靜壓處理對花生分離蛋白表面疏水性的影響Fig.5 The effect of HHP on surface hydrophobicity of PPI

圖6 高靜壓處理對花生球蛋白表面疏水性的影響Fig.6 The effect of HHP on surface hydrophobicity of peanut globulins

由圖5、圖6 可以看出，高靜壓處理導(dǎo)致花生分離蛋白、花生球蛋白表面疏水性大幅度上升，花生分離蛋白在400 MPa 時達(dá)到最高，400 MPa 以上處理表面疏水性略有下降，花生球蛋白則在500 MPa 時達(dá)到最高。這是因?yàn)槌邏禾幚砜梢云茐姆肿觾?nèi)弱的氫鍵和靜電相互作用等非共價(jià)鍵，使蛋白分子展開，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露至分子表面。對比圖3、圖4 可以發(fā)現(xiàn)，乳化性的變化與表面疏水性的變化一致，說明表面疏水性與蛋白的功能性質(zhì)如乳化性等存在一定的正相關(guān)，與大多數(shù)的研究結(jié)果一致。

2.4 高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白游離巰基含量的影響

高靜壓處理對花生分離蛋白、花生球蛋白游離巰基含量的影響，見圖7、圖8。由圖7 可知，花生蛋白游離巰基的含量隨著壓力的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在300MPa 處取得最大值；由圖8 可知，花生球蛋白游離巰基含量隨著壓力上升而下降，但差異不顯著。可能是壓力較小時，蛋白凝聚水平低，SH 較穩(wěn)定，壓力升高引起了蛋白結(jié)構(gòu)的展開，同時分子間發(fā)生SH/S-S 的交換反應(yīng)，形成新的二硫鍵，使游離巰基含量下降。

圖7 高靜壓處理對花生分離蛋白巰基含量的影響Fig.7 The effect of HHP on the content of SH of PPI

圖8 高靜壓處理對花生球蛋白巰基含量的影響Fig.8 The effect of HHP on the content of SH of peanut globulins

3 結(jié)論

中性pH 條件下高靜壓處理可有效的改善花生分離蛋白和花生球蛋白的溶解性和乳化性，但是會降低其乳化穩(wěn)定性。在400 MPa，花生分離蛋白具有最大的乳化性和表面疏水性，花生球蛋白具有最大的溶解性；在500 MPa，花生球蛋白具有最大的乳化性和表面疏水性，花生分離蛋白具有最大的溶解性。隨著壓力的升高，花生球蛋白和花生分離蛋白的游離巰基含量呈下降趨勢。由此可見，高靜壓技術(shù)在對花生蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性改造方面有顯著作用，可以預(yù)見高靜壓技術(shù)在生產(chǎn)新型蛋白食品方面具有巨大的研究價(jià)值。

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