紫外線誘變木醋桿菌及優(yōu)良突變菌種的選育

蔡興蓉，劉冬梅，許燕娜，肖性龍，袁琨

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

纖維素（Cellulose）是自然界最豐富的高分子物質(zhì)，但植物中木質(zhì)素、半纖維素等的存在，使得高純度纖維素的提取、精制成為工業(yè)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大技術(shù)難題[1]。部分細(xì)菌在發(fā)酵培養(yǎng)液中能生產(chǎn)纖維素，稱細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose，簡(jiǎn)稱BC），它作為一種新型的生物材料，具有純度高、結(jié)晶度高、機(jī)械強(qiáng)度高、吸水量高及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品業(yè)、造紙工業(yè)、聲音振動(dòng)膜、液晶材料、人造皮膚、藥物載體等眾多領(lǐng)域[2-3]。

在木醋桿菌（Acetobacter xylinum）、根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobactetium）及假單細(xì)胞菌屬（Pseudomonas）等能發(fā)酵產(chǎn)生BC 的細(xì)菌中，木醋桿菌是產(chǎn)BC 能力最強(qiáng)的菌株[3-4]。BC 是由Acetobacter xylinum 靜止淺盤培養(yǎng)產(chǎn)生，形成凝膠狀堅(jiān)固的網(wǎng)絡(luò)纖維膜（凈聚合物/水分=1/100），具有很好的持水性，但是這種方法存在一些弊端如淺盤表面積大易造成發(fā)酵液大量揮發(fā)損失，生長(zhǎng)緩慢發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)等，導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的提高[5-7]；為提高BC 產(chǎn)量和生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性，很多人進(jìn)行了相關(guān)的研究：1-甲基環(huán)丙烯能提高木醋桿菌產(chǎn)BC 的產(chǎn)量[8]；采用超高壓、紫外線、亞硝酸鹽分別誘變能得到高產(chǎn)的菌株[9-11]；用紫外線和硫酸二乙酯進(jìn)行復(fù)合誘變菌株產(chǎn)BC 干重為8.00 g/L[12]；在Acetobacter xylinum BPR2001 菌株中克隆了一段二鳥苷酸環(huán)化酶（DGC1）基因，構(gòu)建了一株DGC1 基因缺失的突變菌株DD 在發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)量提高36%[13]。盡管如此，還是普遍存在生產(chǎn)菌株不穩(wěn)定、BC 發(fā)酵得率較低、生產(chǎn)成本較高及發(fā)酵原料單一等諸多問(wèn)題，因此，研究提高生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性、產(chǎn)量以及篩選經(jīng)濟(jì)發(fā)酵原料顯得非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

木醋桿菌Acetobacter xylinum CGMCC 5173，為華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 主要儀器

PYX2190S2A 恒溫培養(yǎng)箱：科力電器公司；GZX-9140MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HHS-11-2 電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；01J2003-04 型立式高壓蒸汽殺菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1F 無(wú)菌臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PHS-3C pH 計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；250 mL 錐形瓶、50 mL 錐形瓶、小平皿、大平皿、試管、涂布棒、燒杯、玻棒和紫外燈等市售。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蔗糖、鹽酸、95 %乙醇、KH2PO4、MgSO4·H2O、（NH4）2SO4、檸檬酸、NaOH（分析純）：廣州市化學(xué)試劑廠。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

1）活化用水合培養(yǎng)基（Mixed Medium for Reviving，簡(jiǎn)稱MMR）：蔗糖4%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.2%、蒸餾水100%；作斜面水合培養(yǎng)基為該培養(yǎng)基加入2.5%的瓊脂，簡(jiǎn)稱固體MMR。

2）發(fā)酵用水合培養(yǎng)基（Mixed Medium for Fermentation，簡(jiǎn)稱MMF）：蔗糖6%、蛋白胨0.2%、酵母提取粉0.1 %、KH2PO40.3 %、MgSO4·H2O 0.1 %、（NH4）2SO40.2%、檸檬酸0.1%、95%乙醇1.5%、蒸餾水100%；倒平板水合培養(yǎng)基為該培養(yǎng)基加2.5%的瓊脂，簡(jiǎn)稱固體MMF。

3）發(fā)酵用椰汁培養(yǎng)基（Coconut Milk Medium for Fermentation，簡(jiǎn)稱CMMF）：蔗糖4%、KH2PO40.3%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.4%、椰汁100%。

4）CO-MMF-CMMF：MMF 和CMMF 以4 ∶1 的比例混合得到的培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 原菌株的活化

配取100 mL MMR 于250 mL 錐形瓶中經(jīng)高壓蒸汽滅菌后涼卻至室溫，從冰箱中取出野生型保存菌株，在無(wú)菌條件下從種子斜面上挑取BC 膜放進(jìn)MMR中于30 ℃恒溫箱活化2 d（30 ℃恒溫培養(yǎng)BC 產(chǎn)量最高[14]）。2 d 后再配取100 mL MMR，從第一瓶MMR 中吸取4 mL 含菌液體于該MMR 中，于30 ℃恒溫箱活化2 d。

1.2.2 菌株的紫外線誘變及其篩選

吸取活化好的菌液5 mL/小平皿中，將其放在紫外燈（功率為30 W）正下方25 cm 分別間隔照射3、4 min 和5 min（紫外線每照射1 min 關(guān)閉休息30 s 再照射1 min）。將誘變好的菌液分別吸取2 mL 涂布于大平皿內(nèi)的固體MMF 上，于30 ℃恒溫箱靜態(tài)培養(yǎng)約5 d；觀察大平皿中單菌落的生長(zhǎng)情況，挑取最大，生長(zhǎng)BC質(zhì)量最好的單菌落，即優(yōu)良的菌株于新配的MMR 中活化2 d。優(yōu)良菌株命名方法：如UV31 表示為經(jīng)過(guò)3 min 照射的1 株誘變菌株，其它的類推。

1.2.3 BC 的發(fā)酵生產(chǎn)及干重測(cè)定

以6%接種量吸取活化好的優(yōu)良菌菌液于MMF中靜態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵，每菌株3 個(gè)平行30 mLMMF 于50 mL錐形瓶中培養(yǎng)；待發(fā)酵10 d 后將小錐形瓶中的菌液倒掉留下BC，往里加入0.1 mol/LNaOH 溶液使其剛好能浸沒(méi)BC，然后放到100 ℃水中水浴20 min，取出水洗中性，然后將BC 倒出于已稱過(guò)重量的小平板上，再放到烘箱中80 ℃烘約24 h 至恒重，稱取質(zhì)量。纖維素的產(chǎn)量表示為：纖維素質(zhì)量與培養(yǎng)基體積比（g/L）[2]，測(cè)定結(jié)果表示為產(chǎn)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4 續(xù)代發(fā)酵生產(chǎn)BC

在收獲前一代BC 前，以6%接種量吸取前一代MMF 中菌液于新配MMF 中靜態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵，每菌株3個(gè)平行30 mL MMF，待發(fā)酵10 d 后收獲。稱取干重的方法同上。

1.2.5 MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 種培養(yǎng)基培養(yǎng)比較

以6%接種量吸取野生株、UV32、UV42 菌菌液于新配MMR 中活化2 d，配取MMF、CMMF、CO-MMFCMMF（每瓶/30 mL），以6 %接種量將野生株、UV32、UV42 活化2 d 的菌液分別接種到3 種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基分別做3 個(gè)平行。發(fā)酵10 d 后，比較3 組BC 的厚度、顏色、質(zhì)地及干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變菌株形態(tài)

紫外誘變菌株形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 菌株木醋桿菌CGMCC 5173 經(jīng)紫外線誘變不同時(shí)間后的菌落Fig.1 The colony of Acetobacter xylinum CGMCC 5173 mutated by UV for different time

通過(guò)不同時(shí)間的紫外誘變，觀察到單菌落可知，誘變3、4 min 的效果比較好，能得到單菌落較多，且得到BC 飽滿剔透，誘變5 min 菌生長(zhǎng)單菌落極少，可見(jiàn)誘變5 min 的致死率很高。

2.2 優(yōu)良菌株的BC 產(chǎn)量

誘變菌株纖維產(chǎn)量見(jiàn)表1。

表1 誘變菌株纖維產(chǎn)量Table 1 The BC yield of mutant strains g/L

在誘變得到單菌落中挑出個(gè)體較大，表觀較好的單菌落，分別命名為UV31、UV32、UV33、UV42、UV44、UV51，將它們進(jìn)行活化并投入生產(chǎn)。其中UV31、UV32、UV33、UV44 第一代產(chǎn)量都比野生菌高，其中最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍。如表1 所示。本研究中BC 產(chǎn)量范圍在26.00 g/L～36.0 0 g/L。趙瓊等紫外誘變，得到誘變菌株產(chǎn)量提高1.5 倍，但是產(chǎn)量?jī)H為3.52 g/L[10]；文獻(xiàn)[15]綜述了近幾年為提高BC 進(jìn)行的研究，從菌種選育到改良，再至發(fā)酵優(yōu)化，BC 的干重為2.00 g/L～13.00 g/L，比與本研究的低，其可能的原因有：1）選用野生株個(gè)體存在差異；2）發(fā)酵時(shí)采用發(fā)酵容器不同，木醋桿菌為需氧菌，和氧氣的接觸面越大越有利于BC 產(chǎn)量的提高；3）發(fā)酵培養(yǎng)基不同；4）收獲周期不一樣等。經(jīng)比較，本研究中所得菌株較優(yōu)良，其BC產(chǎn)量也較高，具有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的潛力。

2.3 誘變菌株續(xù)代培養(yǎng)

對(duì)以上優(yōu)良菌株進(jìn)行續(xù)代培養(yǎng)，產(chǎn)量結(jié)果如表2所示。

表2 續(xù)代發(fā)酵細(xì)菌纖維產(chǎn)量Table 2 The BC yield of continued generations g/L

其中誘變菌株UV31、UV32、UV33 連續(xù)生產(chǎn)四代產(chǎn)量分別穩(wěn)定在23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。菌株UV44 和UV51 分別在第三代和第二、四代出現(xiàn)BC 的產(chǎn)量不穩(wěn)定，因此沒(méi)有進(jìn)一步的考慮這兩個(gè)菌株的生產(chǎn)情況。趙瓊等的研究表明菌株C544續(xù)代發(fā)酵產(chǎn)量同樣穩(wěn)定，只是產(chǎn)量?jī)H在3.49 g/L～3.60 g/L 之間[10]，其產(chǎn)量比本研究的低，表明所得的紫外誘變菌株是穩(wěn)定的。

2.4 3 種培養(yǎng)基發(fā)酵得到BC 的形態(tài)及產(chǎn)量比較

用MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 種培養(yǎng)基培養(yǎng)野生菌、UV32、UV42 菌株，分析比較3 組BC 的厚度、顏色、質(zhì)地及干重，結(jié)果如圖2、表3 所示。

圖2 UV33 菌株在3 種培養(yǎng)基中發(fā)酵的BC 形態(tài)Fig.2 The form of the BC fermented by UV32 strain in three different kinds of medium

表3 3 種不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的BC 的形態(tài)及產(chǎn)量對(duì)比Table 3 Contrast of form and yield of the BC fermented by three different kinds of medium

CMMF 培養(yǎng)BC 產(chǎn)量最高，為19.94 g/L～39.97 g/L，形態(tài)飽滿，即持水性好，手感柔軟，但不結(jié)實(shí)易穿透；CO-MMF-CMMF 培養(yǎng)BC 產(chǎn)量一般，為16.24 g/L～31.09 g/L，各特性比較接近CMMF 培養(yǎng)得到的BC；MMF 培養(yǎng)BC 產(chǎn)量最少，為10.17 g/L～22.28 g/L，但最結(jié)實(shí)不易穿透，即機(jī)械性能最好。三者的顏色也有差異，如圖2 所示。本研究驗(yàn)證了BC 生物合成具有可調(diào)控性，培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件的不同均可影響其合成與結(jié)構(gòu)[3]。故可選取不同培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)出不同特性的BC。

3 結(jié)論

本研究表明對(duì)木醋桿菌野生菌進(jìn)行紫外誘變能有效地得到高產(chǎn)的菌株，且紫外誘變時(shí)間在3 min～4 min 為效果最佳；經(jīng)篩選得到UV31、UV32、UV33、UV42、UV44 五株產(chǎn)量高的突變菌株，其中產(chǎn)量最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍；菌株UV31、UV32、UV33、UV42 連續(xù)發(fā)酵四代產(chǎn)量穩(wěn)定，分別為23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。CMMF 培養(yǎng)能得到高產(chǎn)量BC，為19.94 g/L～39.97 g/L，但不結(jié)實(shí)；MMF培養(yǎng)能得到結(jié)實(shí)的BC 但產(chǎn)量低，為10.17 g/L～22.28 g/L；CO-MMF-CMMF 培養(yǎng)能得到較結(jié)實(shí)且產(chǎn)量為16.24 g/L～31.09 g/L 的BC。結(jié)果表明，紫外線誘變3 min 菌株的BC 產(chǎn)量有提高且3 代～4 代發(fā)酵產(chǎn)量保持穩(wěn)定，COMMF-CMMF 發(fā)酵能得到機(jī)械性和產(chǎn)量均適中的BC。

這個(gè)研究只涉及到野生菌的誘變、選育以及培養(yǎng)發(fā)酵，未涉及到菌株的保存。由于木醋桿菌的性狀極其不穩(wěn)定，容易受保存條件及保存的時(shí)間影響，所以木醋桿菌的保存非常重要。因此希望在選出優(yōu)良菌種后，能對(duì)菌株的保存條件進(jìn)行深入研究，以便能更好地生產(chǎn)BC，更好地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，造福人類。

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