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    HPLC-MS/MS法研究大鼠胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A的體外代謝作用

    2013-01-28 10:32:58馬桂劼張妍張明春解軍波龐廣昌
    食品研究與開發(fā) 2013年19期
    關(guān)鍵詞:分子離子酸棗仁皂苷

    馬桂劼,張妍,張明春,2,解軍波,2,*,龐廣昌,2

    (1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300134)

    酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子,具有斂汗、養(yǎng)肝、寧心安神等多種功效[1-2]?,F(xiàn)代研究表明,酸棗仁皂苷A 是酸棗仁的有效成分之一,具有鎮(zhèn)靜、催眠,降壓、降脂、抗缺氧、增強(qiáng)免疫功能以及對(duì)心臟的保護(hù)等廣泛的藥理效應(yīng),其保健應(yīng)用前景十分誘人[3-4]。

    近年來(lái),有關(guān)酸棗仁皂苷A 的研究雖然已有較多的報(bào)道,但酸棗仁皂苷A 在機(jī)體代謝過(guò)程中變化的相關(guān)文獻(xiàn)尚不多見(jiàn)[5],尤其是胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A 的代謝情況還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集大鼠胃內(nèi)容物,在體外環(huán)境中孵育酸棗仁皂苷A,并采用HPLC-MS/MS技術(shù),對(duì)酸棗仁皂苷A 在其胃內(nèi)容物中的代謝過(guò)程進(jìn)行研究,為闡明該活性成分在胃腸道中的代謝機(jī)制及其生物活性作用機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    Agilent 1100 高效液相色譜儀:G1312B 二元泵、G1316B 柱溫箱、G1367D 自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent,USA);G6410B Triple Quad LC/MS;Masshunter 色 譜 工 作 站(Agilent,USA);Waters YMCTMODS-AQ S-5 120A(2.0×100 mm,3.5 μm)色譜柱;BP211D 型十萬(wàn)分之一電子天平:Satorius(Germany);ZH-2 型渦流混合器:天津大學(xué)無(wú)線電廠;酸棗仁皂苷A(純度>98%):成都思科華生物技術(shù)有限公司;甲醇、水均為色譜純:J.T.Baker(USA)。Wistar 雄性大鼠體重(200±20)g:天津藥物研究所。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 大鼠胃內(nèi)容物的制備

    健康Wistar 大鼠,試驗(yàn)前禁食24 h,自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉后,剪取胃,用10 mL 人工胃液(pH 1.0)沖洗并收集胃內(nèi)容物溶液,4 000 r/min離心15 min,取上清液-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 色譜質(zhì)譜條件

    流動(dòng)相為(0.1 %甲酸溶液)-甲醇(50∶50);柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。電噴霧ESI源,掃描方式:ESI(-),電噴霧電壓:4 000 V,霧化氣體:N2,霧化氣壓力:241.15 KPa;干燥氣體:N2,流速:8 L/min;離子源溫度:350 ℃,碰撞氣體:高純氮?dú)猓鲎矚鈮毫Γ?.15 MPa。酸棗仁皂苷A 質(zhì)譜分析的條件參數(shù):碎裂電壓360 V,碰撞能量60 V。

    1.2.3 對(duì)照品溶液的配制

    精密稱取酸棗仁皂苷A,以甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、10 μg/mL 和20 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

    1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    精密吸取相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液100 μL 于EP管中,揮干,分別加入胃內(nèi)容物溶液100 μL,渦旋5 min,用流動(dòng)相溶液稀釋100 倍后,用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積(Y)對(duì)酸棗仁皂苷A 濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=382.17X+0.833(r=0.999 8)。

    1.2.5 精密度試驗(yàn)

    按1.2.4 項(xiàng),制備高、中、低(1、10、20 μg/mL)3 個(gè)濃度樣品供試液,并稀釋100 倍后連續(xù)進(jìn)樣5 次,測(cè)定藥物濃度,計(jì)算RSD 值,分別為2.57 %、2.05 %、2.34 %,表明精密度良好。

    1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    按1.2.4 項(xiàng),制備高、中、低(1、10、20 μg/mL)3 個(gè)濃度樣品供試液,分別于-20 ℃條件下保存,分別于0~12h 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取出,室溫融化后,并稀釋100 倍后依法測(cè)定,測(cè)定藥物濃度,計(jì)算RSD 值,分別為2.87 %、2.51%、1.83%,表明在0~12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    1.2.7 回收率試驗(yàn)

    按1.2.4 項(xiàng),制備高、中、低(1、10、20 μg/mL)3 個(gè)濃度樣品供試液。每個(gè)濃度水平3 個(gè)樣品,稀釋100倍后,依法測(cè)定其酸棗仁皂苷A 含量(A)。同時(shí)測(cè)定同濃度對(duì)照品溶液中酸棗仁皂苷A 含量(B),按公式回收率=(A/B)×100%,計(jì)算相應(yīng)回收率及其RSD 值。經(jīng)測(cè)定,回收率分別為96.57 %(RSD =1.52 %)、102.30 %(RSD=2.09%)、100.22%(RSD=2.63%),符合方法學(xué)的要求。

    1.2.8 胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A 的代謝作用

    精密量取濃度為1.0 mg/mL 的酸棗仁皂苷A 貯備液160 μL 于可密封的磨口玻璃試管中,揮干。于37 ℃孵育活化胃內(nèi)容物溶液30 min,然后取此液8 mL 加入含藥的玻璃試管中,渦旋10 min 混勻,于37 ℃下培養(yǎng),分別于0、1、2、3、6 h 時(shí)間點(diǎn)取樣,稀釋100 倍后,依法檢測(cè)。本試驗(yàn)以不含大鼠胃內(nèi)容物的人工胃液(pH 1.0)對(duì)酸棗仁皂苷A 進(jìn)行上述試驗(yàn),作為空白對(duì)照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酸棗仁皂苷A 在體外模擬胃內(nèi)容物中的降解

    結(jié)果顯示,酸棗仁皂苷A 在胃內(nèi)容物中的降解反應(yīng)均迅速啟動(dòng),并有明顯的降解趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)曲線擬合,分別得到C-T 和lnC-T 的擬合方程為Y=-1.815 6 X+18.445(r=0.980 4)和Y=-0.143 8 X+2.954 8(r=0.986 0),可知該反應(yīng)接近于一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程,6 h 后其降解百分?jǐn)?shù)為55.63%。通過(guò)空白對(duì)照試驗(yàn)得到酸棗仁皂苷A在人工胃液中的降解擬合方程為Y=-0.6379 X+20.057(r = 0.996 4),其降解百分?jǐn)?shù)為19.04 %。由此看出藥物雖在人工胃液的酸性環(huán)境下有所降解,但降解速率常數(shù)明顯小于其在胃內(nèi)容物中的降解速率常數(shù)(0.637 9 <1.815 6),且其降解百分?jǐn)?shù)也小于胃內(nèi)容物中的數(shù)值。由此可以推測(cè),在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的6 h 內(nèi),大部分藥物通過(guò)胃內(nèi)容物作用代謝為其他形式,可能與胃內(nèi)容物中的微生物作用等相關(guān)。

    2.2 酸棗仁皂苷A 代謝產(chǎn)物的確定

    根據(jù)酸棗仁皂苷A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)推測(cè)其可在代謝過(guò)程中逐步脫去側(cè)鏈上的糖基,推測(cè)得到有可能形成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu),并分別計(jì)算其分子量。分別取空白樣品溶液和不同時(shí)間點(diǎn)的樣品溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析檢測(cè),通過(guò)總離子流MS2-Scan 掃描和二級(jí)質(zhì)譜Product Ion Scan 掃描,分別得到代謝產(chǎn)物的母離子與子離子的質(zhì)荷比m/z,并對(duì)其檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定與上述推測(cè)結(jié)果相符的代謝產(chǎn)物,結(jié)果見(jiàn)表1 和圖1。

    表1 大鼠胃內(nèi)容物中酸棗仁皂苷A 及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 Parameter of mass spectra of Jujuboside A and its metabolites in rat’s stomach contents

    圖1 M0、M1、M2 和M3 的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of M0,M1,M2 and M3

    M0:準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 1 205.1,其二級(jí)質(zhì)譜生成碎片離子m/z 1 073.2 與749.5。M0與酸棗仁皂苷A 對(duì)照品色譜行為和質(zhì)譜行為完全一致,證明此化合物為母體成分,即酸棗仁皂苷A 藥物原型。

    M1:準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 1 043.4,比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少161.7,推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去一分子葡萄糖,其二級(jí)質(zhì)譜中生成了碎片離子m/z 911.2 與749.5。M1與酸棗仁皂苷B 對(duì)照品色譜行為和質(zhì)譜行為完全一致,證明此產(chǎn)物為酸棗仁皂苷B。

    M2:準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 911.4,比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少293.7(162+132),推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去一分子葡萄糖和吡喃木糖,其二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子m/z 749.3,為m/z 911.4 脫去一分子葡萄糖后的碎片離子,由此推斷,M2是酸棗仁皂苷A 脫去一分子葡萄糖和一分子吡喃木糖后得到的代謝產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

    M3:準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 471.3,比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少733.8(162×2+132+132+146),推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去兩分子葡萄糖、一分子吡喃木糖、一分子阿拉伯糖和一分子鼠李糖,由此推斷,M3是酸棗仁皂苷A 脫去糖基后得到的酸棗仁皂苷元,其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

    圖2 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of the metabolites

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A 在大鼠體外胃內(nèi)容物中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析,同時(shí)檢測(cè)到酸棗仁皂苷A 和3 種相關(guān)代謝產(chǎn)物M1、M2和M3。其中M3為皂苷元,初步推測(cè)其可能是酸棗仁皂苷A 在胃內(nèi)容物中的的最終代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)可以為酸棗仁皂苷A 在體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特征的解析提供初步的理論依據(jù)。

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