HPLC-MS/MS法研究大鼠胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A的體外代謝作用

馬桂劼，張妍，張明春，2，解軍波，2，*，龐廣昌，2

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，具有斂汗、養(yǎng)肝、寧心安神等多種功效[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，酸棗仁皂苷A 是酸棗仁的有效成分之一，具有鎮(zhèn)靜、催眠，降壓、降脂、抗缺氧、增強(qiáng)免疫功能以及對(duì)心臟的保護(hù)等廣泛的藥理效應(yīng)，其保健應(yīng)用前景十分誘人[3-4]。

近年來(lái)，有關(guān)酸棗仁皂苷A 的研究雖然已有較多的報(bào)道，但酸棗仁皂苷A 在機(jī)體代謝過(guò)程中變化的相關(guān)文獻(xiàn)尚不多見(jiàn)[5]，尤其是胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A 的代謝情況還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集大鼠胃內(nèi)容物，在體外環(huán)境中孵育酸棗仁皂苷A，并采用HPLC-MS/MS技術(shù)，對(duì)酸棗仁皂苷A 在其胃內(nèi)容物中的代謝過(guò)程進(jìn)行研究，為闡明該活性成分在胃腸道中的代謝機(jī)制及其生物活性作用機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀：G1312B 二元泵、G1316B 柱溫箱、G1367D 自動(dòng)進(jìn)樣器（Agilent，USA）；G6410B Triple Quad LC/MS；Masshunter 色 譜 工 作 站（Agilent，USA）；Waters YMCTMODS-AQ S-5 120A（2.0×100 mm，3.5 μm）色譜柱；BP211D 型十萬(wàn)分之一電子天平：Satorius（Germany）；ZH-2 型渦流混合器：天津大學(xué)無(wú)線電廠；酸棗仁皂苷A（純度＞98%）：成都思科華生物技術(shù)有限公司；甲醇、水均為色譜純：J.T.Baker（USA）。Wistar 雄性大鼠體重（200±20）g：天津藥物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠胃內(nèi)容物的制備

健康Wistar 大鼠，試驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉后，剪取胃，用10 mL 人工胃液（pH 1.0）沖洗并收集胃內(nèi)容物溶液，4 000 r/min離心15 min，取上清液-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色譜質(zhì)譜條件

流動(dòng)相為（0.1 %甲酸溶液）-甲醇（50∶50）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。電噴霧ESI源，掃描方式：ESI（-），電噴霧電壓：4 000 V，霧化氣體：N2，霧化氣壓力：241.15 KPa；干燥氣體：N2，流速：8 L/min；離子源溫度：350 ℃，碰撞氣體：高純氮?dú)猓鲎矚鈮毫Γ?.15 MPa。酸棗仁皂苷A 質(zhì)譜分析的條件參數(shù)：碎裂電壓360 V，碰撞能量60 V。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取酸棗仁皂苷A，以甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、10 μg/mL 和20 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液100 μL 于EP管中，揮干，分別加入胃內(nèi)容物溶液100 μL，渦旋5 min，用流動(dòng)相溶液稀釋100 倍后，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積（Y）對(duì)酸棗仁皂苷A 濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=382.17X+0.833（r=0.999 8）。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

按1.2.4 項(xiàng)，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個(gè)濃度樣品供試液，并稀釋100 倍后連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算RSD 值，分別為2.57 %、2.05 %、2.34 %，表明精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.4 項(xiàng)，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個(gè)濃度樣品供試液，分別于-20 ℃條件下保存，分別于0～12h 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取出，室溫融化后，并稀釋100 倍后依法測(cè)定，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算RSD 值，分別為2.87 %、2.51%、1.83%，表明在0～12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.7 回收率試驗(yàn)

按1.2.4 項(xiàng)，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個(gè)濃度樣品供試液。每個(gè)濃度水平3 個(gè)樣品，稀釋100倍后，依法測(cè)定其酸棗仁皂苷A 含量（A）。同時(shí)測(cè)定同濃度對(duì)照品溶液中酸棗仁皂苷A 含量（B），按公式回收率=（A/B）×100%，計(jì)算相應(yīng)回收率及其RSD 值。經(jīng)測(cè)定，回收率分別為96.57 %（RSD =1.52 %）、102.30 %（RSD=2.09%）、100.22%（RSD=2.63%），符合方法學(xué)的要求。

1.2.8 胃內(nèi)容物對(duì)酸棗仁皂苷A 的代謝作用

精密量取濃度為1.0 mg/mL 的酸棗仁皂苷A 貯備液160 μL 于可密封的磨口玻璃試管中，揮干。于37 ℃孵育活化胃內(nèi)容物溶液30 min，然后取此液8 mL 加入含藥的玻璃試管中，渦旋10 min 混勻，于37 ℃下培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、6 h 時(shí)間點(diǎn)取樣，稀釋100 倍后，依法檢測(cè)。本試驗(yàn)以不含大鼠胃內(nèi)容物的人工胃液（pH 1.0）對(duì)酸棗仁皂苷A 進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁皂苷A 在體外模擬胃內(nèi)容物中的降解

結(jié)果顯示，酸棗仁皂苷A 在胃內(nèi)容物中的降解反應(yīng)均迅速啟動(dòng)，并有明顯的降解趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)曲線擬合，分別得到C-T 和lnC-T 的擬合方程為Y=-1.815 6 X+18.445（r=0.980 4）和Y=-0.143 8 X+2.954 8（r=0.986 0），可知該反應(yīng)接近于一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，6 h 后其降解百分?jǐn)?shù)為55.63%。通過(guò)空白對(duì)照試驗(yàn)得到酸棗仁皂苷A在人工胃液中的降解擬合方程為Y=-0.6379 X+20.057（r = 0.996 4），其降解百分?jǐn)?shù)為19.04 %。由此看出藥物雖在人工胃液的酸性環(huán)境下有所降解，但降解速率常數(shù)明顯小于其在胃內(nèi)容物中的降解速率常數(shù)（0.637 9 ＜1.815 6），且其降解百分?jǐn)?shù)也小于胃內(nèi)容物中的數(shù)值。由此可以推測(cè)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的6 h 內(nèi)，大部分藥物通過(guò)胃內(nèi)容物作用代謝為其他形式，可能與胃內(nèi)容物中的微生物作用等相關(guān)。

2.2 酸棗仁皂苷A 代謝產(chǎn)物的確定

根據(jù)酸棗仁皂苷A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)推測(cè)其可在代謝過(guò)程中逐步脫去側(cè)鏈上的糖基，推測(cè)得到有可能形成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并分別計(jì)算其分子量。分別取空白樣品溶液和不同時(shí)間點(diǎn)的樣品溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析檢測(cè)，通過(guò)總離子流MS2-Scan 掃描和二級(jí)質(zhì)譜Product Ion Scan 掃描，分別得到代謝產(chǎn)物的母離子與子離子的質(zhì)荷比m/z，并對(duì)其檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定與上述推測(cè)結(jié)果相符的代謝產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)表1 和圖1。

表1 大鼠胃內(nèi)容物中酸棗仁皂苷A 及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 Parameter of mass spectra of Jujuboside A and its metabolites in rat’s stomach contents

圖1 M0、M1、M2 和M3 的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of M0,M1,M2 and M3

M0：準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 1 205.1，其二級(jí)質(zhì)譜生成碎片離子m/z 1 073.2 與749.5。M0與酸棗仁皂苷A 對(duì)照品色譜行為和質(zhì)譜行為完全一致，證明此化合物為母體成分，即酸棗仁皂苷A 藥物原型。

M1：準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 1 043.4，比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少161.7，推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去一分子葡萄糖，其二級(jí)質(zhì)譜中生成了碎片離子m/z 911.2 與749.5。M1與酸棗仁皂苷B 對(duì)照品色譜行為和質(zhì)譜行為完全一致，證明此產(chǎn)物為酸棗仁皂苷B。

M2：準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 911.4，比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少293.7（162+132），推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去一分子葡萄糖和吡喃木糖，其二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子m/z 749.3，為m/z 911.4 脫去一分子葡萄糖后的碎片離子，由此推斷，M2是酸棗仁皂苷A 脫去一分子葡萄糖和一分子吡喃木糖后得到的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

M3：準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z 471.3，比酸棗仁皂苷A 的準(zhǔn)分子離子m/z 少733.8（162×2+132+132+146），推測(cè)該代謝物可能在母體成分的基礎(chǔ)上脫去兩分子葡萄糖、一分子吡喃木糖、一分子阿拉伯糖和一分子鼠李糖，由此推斷，M3是酸棗仁皂苷A 脫去糖基后得到的酸棗仁皂苷元，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of the metabolites

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A 在大鼠體外胃內(nèi)容物中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析，同時(shí)檢測(cè)到酸棗仁皂苷A 和3 種相關(guān)代謝產(chǎn)物M1、M2和M3。其中M3為皂苷元，初步推測(cè)其可能是酸棗仁皂苷A 在胃內(nèi)容物中的的最終代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)可以為酸棗仁皂苷A 在體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特征的解析提供初步的理論依據(jù)。

[1] 張雪,丁長(zhǎng)河,李和平.酸棗仁的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):348-350

[2] 劉魁,戎欣玉,王榮耕,等. 酸棗仁乳飲料的研制[J].食品研究與開發(fā),2007,28(10):92-94

[3] 黃宜生,賈鈺華,孫學(xué)剛,等.酸棗仁皂苷A 對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心律失常及Bcl-2、Bax 表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(1):51-54

[4] You Z,Xia Q, Liang F, et al. Effects on the expression of GABAA receptor subunits by Jujuboside A treatment in rat hippocampal neurons[J]. Journal of ethnopharmacology,2010,128(2):419-423

[5] 尚磊,竇強(qiáng).HPLC 測(cè)定安神顆粒中酸棗仁皂苷A 及B 的含量[J].食品與藥品,2012,14(11):434-435