兩種方法對水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測的對比分析

鄧 婷梁漪蓮駱 瓊黃慧清

（1廣西桂林市自來水公司，廣西桂林541001） （2廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

兩種方法對水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測的對比分析

鄧 婷1梁漪蓮1駱 瓊1黃慧清2

（1廣西桂林市自來水公司，廣西桂林541001） （2廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

利用多管發(fā)酵法和酶底物法檢測水中的總大腸菌群與大腸埃希氏菌，對比兩種方法的適用性、靈敏度等，對比分析多管發(fā)酵法和酶底物法2種方法對水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測情況。結(jié)果表明，2種方法對適用性菌株存在差異；在1 MPN/100mL濃度下，酶底物法更加靈敏；在加標(biāo)樣和平行樣檢測中，酶底物法表現(xiàn)更為穩(wěn)定。由此可得，在水中檢測總大腸菌群與大腸埃希氏菌可應(yīng)用多管發(fā)酵法和酶底物法，但與多管發(fā)酵法相比，酶底物法優(yōu)勢顯著，用時較短、操作簡單、便于觀察，值得推廣。

多管發(fā)酵法；酶底物法；總大腸菌群；大腸埃希氏菌；檢測結(jié)果

隨著人們生活水平的提高，人們對自來水水質(zhì)提出了更高的要求。目前，自來水微生物污染問題嚴(yán)峻，相關(guān)問題得到了社會各界的高度關(guān)注。近幾年，我國學(xué)者報道了因自來水傳播傳染性疾病的診治與預(yù)等。為了改善水質(zhì)，為廣大群眾提供安全與健康的自來水，我國實行《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，其中微生物指標(biāo)有：菌落總數(shù)、總大腸菌群、大腸埃希氏菌和耐熱大腸菌群?！渡铒嬘盟畼?biāo)準(zhǔn)檢驗方法 微生物指標(biāo)》中提供了幾種不同的檢測方法，總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測方法有濾膜法、多管發(fā)酵法、酶底物法，各方法均以發(fā)酵乳糖為基礎(chǔ)。為了明確不同方法的應(yīng)用價值，本文對自來水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的2種檢測方法展開了對比分析，以期為自來水中微生物檢測方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MMO-MUG培養(yǎng)基，美國DEXX公司；乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、EC-MUG培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱，36℃±1℃、44.5℃±0.5℃；紫外燈，波長為366nm。

1.2 方法

1.2.1 試驗前準(zhǔn)備

選用培養(yǎng)基：總大腸菌群檢測利用乳糖蛋白胨培養(yǎng)基和MMO-MUG培養(yǎng)基，大腸埃希氏菌檢測利用EC-MUG培養(yǎng)基與MMO-MUG培養(yǎng)基。

準(zhǔn)備：適用性菌株，EIEC培養(yǎng)物，加標(biāo)水樣，普通含菌水樣，MMO-MUG培養(yǎng)基粉末（2.7±0.4）g；根據(jù)配制要求制備的EC-MUG培養(yǎng)基與乳糖蛋白胨培養(yǎng)液。

1.2.2 方法原理

總大腸菌群可利用MMO-MUG培養(yǎng)基進行檢測，其可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，其可分解培養(yǎng)基的ONPG，此后培養(yǎng)基便會出現(xiàn)顏色變化；而大腸埃希氏菌則借助EC-MUG培養(yǎng)基與MMO-MUG培養(yǎng)基檢測，其可產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，待其分解后可使MUG熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，再經(jīng)紫外燈光照射，可出現(xiàn)特征性熒光。

1.2.3 試驗方法

1.2.3.1 適用性試驗

取分裝滅菌好的MMO-MUG培養(yǎng)液、EC-MUG培養(yǎng)液、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（10mL/管），向各管中分別加入試驗菌混懸液，其中EC-MUG培養(yǎng)液于44.5℃±0.5℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，MMO-MUG培養(yǎng)液和乳糖蛋白胨培養(yǎng)液放置在36℃±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3.2 靈敏度試驗

取經(jīng)24 h培養(yǎng)后的侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）培養(yǎng)物，將其制成0.5麥?zhǔn)隙染海?0倍梯度稀釋，至菌量為1500 MPN/100mL～1 MPN/100mL進行試驗，每個菌液濃度做2個平行試驗，對比不同細(xì)菌濃度下，多管發(fā)酵法和酶底物法的靈敏度。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗

以10份加入EIEC的加標(biāo)水樣及62份水樣品為研究對象，對比2種檢測方法，分析其總大腸菌群結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 適用性試驗

適用性試驗結(jié)果表明，多管發(fā)酵法與酶底物法用于檢測宋內(nèi)氏志賀氏菌、綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌時，測定結(jié)果存在差異。適用性試驗結(jié)果見表1。

表1 適用性試驗結(jié)果

2.2 靈敏度試驗

靈敏度試驗結(jié)果表明，在1 MPN/100mL濃度下，酶底物法可見黃色與藍色熒光；而多管發(fā)酵法未見熒光。靈敏度試驗結(jié)果見表2。

表2 靈敏度試驗結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性試驗

以10份加標(biāo)水樣為研究對象進行檢測，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)試驗結(jié)果

由表3可知，酶底物法和多管發(fā)酵法結(jié)果均落在置信區(qū)間內(nèi)，且2種方法之間不存在顯著性差異，酶底物法結(jié)果方差較小，說明酶底物法結(jié)果的偏離度小。以62份含菌水樣為研究對象進行檢測，結(jié)果見表4。

表4 含菌水樣試驗結(jié)果

由表4可知，2種方法不存在顯著性差異，根據(jù)結(jié)果分析，酶底物法在均一性方面優(yōu)于多管發(fā)酵法。

3 討 論

總大腸菌群來源于動物腸道、自然環(huán)境，具體包括檸檬酸菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬及腸肝菌屬等；而大腸埃希氏菌又稱大腸桿菌，其作為優(yōu)勢菌群，廣泛分布在腸道內(nèi)，在其作用下，有效保證了宿主健康及其生理功能的發(fā)揮，但如果宿主免疫力、抵抗力下降，其組織器官受細(xì)菌侵入，則會誘發(fā)腸外感染，隨之便形成了致病性大腸埃希氏菌，常出現(xiàn)腹瀉等腸道疾病。我國在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中增設(shè)了關(guān)于大腸埃希氏菌的檢驗要求，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，常見的污染指標(biāo)有3種，分別為大腸埃希氏菌、總大腸菌群及糞大腸菌群，在水、食品加工方面，為了明確其衛(wèi)生狀況，常選用總大腸菌群為指標(biāo)；而在糞便污染、衛(wèi)生處理方面，常選用大腸埃希氏菌為指標(biāo)。

目前，在全球范圍內(nèi)，酶底物法的應(yīng)用較為廣泛與普遍，經(jīng)不斷探索與實踐，此方法日漸成熟，國家與相關(guān)組織大多推薦應(yīng)用酶底物法，同時也使用多管發(fā)酵法與濾膜法等，上述方法均收錄于《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)》。我國檢測部門以多管發(fā)酵法為主，在檢測實踐中，需要稀釋樣品、記錄陽性管數(shù)、檢索查找等，試驗開始到得出結(jié)果所需時間約為48 h，與其相比，酶底物法操作簡便、耗時較少，不僅提高了工作效率，也保證了檢測質(zhì)量。

為了了解2種檢測方法的應(yīng)用價值，本文選用多管發(fā)酵法與酶底物法進行了對比研究。適用性試驗結(jié)果表明，2種方法對試驗采用的適用性菌株的測定結(jié)果存在差異；經(jīng)靈敏度試驗可知，與多管發(fā)酵法相比，酶底物法更加靈敏，在1 MPN/100mL濃度下仍可穩(wěn)定檢出。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，2種方法沒有表現(xiàn)出顯著性差異，但與多管發(fā)酵法相比，酶底物法的時間較短，其在24 h內(nèi)便可完成，且操作簡單。

綜上所述，與多管發(fā)酵法相比，應(yīng)用酶底物法檢測自來水中總大腸菌群與大腸埃希氏菌，更加有效、便捷，值得推廣。

［1］楊靜.致泌尿道感染的菌群分布、大腸埃希菌耐藥性分析及其基因型初步研究［D］.安徽：安徽醫(yī)科大學(xué)，2012：8-12.

［2］張小東.水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌和大腸菌群快速檢測技術(shù)研究［D］.廈門：集美大學(xué)，2014：9-12.

［3］胡朝友.Taq Man探針熒光PCR法定量檢測水中大腸埃希氏菌方法建立和應(yīng)用［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2014：11-14.

［4］嵇志遠(yuǎn)，王維瑋，文揚.M I瓊脂法同時檢測環(huán)境水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌［J］.巖礦測試，2013（5）：747-752.

［5］AROMPR E，SPPIERRE，JBANDART，eta1.Detection and enum eration ofcoliform s in drinking water：currentm e thods and em erging approaches［J］.Journal of Microbiological Methods，2012，49（2）：31-54.

振興民族工業(yè)的人民科學(xué)家微生物學(xué)奠基人方心芳院士誕辰110周年紀(jì)念活動在太原舉行

2017年3月16日，紀(jì)念《山西醋》作者方心芳院士誕辰110周年紀(jì)念活動在太原召開。大會由中國微生物學(xué)會、中國生物工程學(xué)會發(fā)起主辦，山西省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會、山西省食品工業(yè)研究所協(xié)辦，山西老陳醋集團有限公司承辦。來自海內(nèi)外的專家學(xué)者、釀醋同行以及方老的家人等參加此次紀(jì)念會。中國微生物學(xué)會常務(wù)副秘書長楊?；?，中國生物工程學(xué)會常務(wù)副秘書長張宏翔，山西老陳醋集團有限公司董事長、國家級非物質(zhì)遺產(chǎn)代表性傳承人郭俊陸，中國科學(xué)院微生物所研究員、方心芳研究專家程光勝，中國微生物學(xué)先驅(qū)、開拓者方心芳之子方定一，臺灣中華酒業(yè)發(fā)展協(xié)進會秘書長歐陽港生，國家文化部原副部長、國家圖書館名譽館長周和平等發(fā)表了主題演講。會后，方心芳院士家屬及各級領(lǐng)導(dǎo)等共同為方心芳院士雕塑揭幕。

（山西老陳醋集團有限公司）

Two methods'comparative analysis of detecting total coliform bacteria and E.colibacteria in water

DENG Ting1*LIANG Yilian1LUO Qiong1HUANG Huiqing2

1（Guangxi guilin water company，Guangxi Guilin 541001，China）

2（Guangdongfood and drugvocational college,Guangdong Guangzhou510520，China）

By using the multiple tube fermentation and enzyme substrate method to detect total coliform bacteria and E.coli bacteria in water,compared the applicability,sensitivity of the two methods.The results show that the two methods of applicability strains is different；Under 1 MPN/100mL concentration,enzyme substrate method is more sensitive.In the prototype and parallel sample tests,enzyme substrate performance is more stable.Multiple tube fermentation and enzyme substrates can be used in water detection of total coliforms and e.coli,but compared with the multiple tube fermentation,enzyme substrate has advantage significantly,short and simple operation,easy to observe,and is worth promoting.

multi-tube fermentation；enzyme substrate；total coliformbacteria；E.coli bacteria；test results

TS207.4

A

1673-6044（2017）01-0052-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.01.015

*鄧婷，女，1984年出生，2009年畢業(yè)于中山大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)，工程師。

2016-12-01