腰椎間盤退變基因治療的研究進展

李 翔，李新志

腰椎間盤退變 (LDD)是引起一系列脊柱疾病的主要原因，但現(xiàn)有的保守治療及手術(shù)治療均是針對患者臨床癥狀［1］，并不真正符合LDD的發(fā)病機制及病理生理學特點。為尋求更好的治療方法，基因治療逐漸進入人們的視線并成為近些年研究的熱點。LDD基因治療主要涉及目的基因的篩選、載體的選擇、轉(zhuǎn)染方法和轉(zhuǎn)基因的表達調(diào)控等，現(xiàn)就其研究進展綜述如下。

1 基因治療的必要性

LDD是由基因因素和環(huán)境因素相互作用的多因素疾病。Battié等［2－3］對不同環(huán)境下成長的同卵雙胞胎進行的長期研究顯示，LDD可能主要受遺傳因素的影響，環(huán)境因素的影響可能非常有限。Patel等［4］通過人口數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)對猶他州的1 264例LDD患者進行健康和家譜分析，發(fā)現(xiàn)LDD患者有明顯的家族聚集性。Kepler等［5］認為許多特定的遺傳風險基因與LDD密切相關(guān)，個人發(fā)生LDD風險的75%可歸因于遺傳因素。傳統(tǒng)觀點認為基因治療主要針對的是經(jīng)典遺傳性疾病，但基因治療技術(shù)的進步揭示了其在后天獲得性慢性疾病中的潛在用途。由LDD引發(fā)的腰椎疾病也是基因治療的良好適應證［6］?；蛑委煹闹饕椒ㄊ抢幂d體將治療性基因轉(zhuǎn)染到靶細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)基因細胞就會持續(xù)產(chǎn)生治療所需的產(chǎn)物。雖然基因治療的技術(shù)要求復雜，但一旦成熟應用于臨床，可以想象，一次基因或蛋白因子注射會給患者帶來多么大的好處。

2 目的基因

對于基因治療而言，找到與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的目的基因是關(guān)鍵問題。目前，常用候選基因的方法來識別與LDD相關(guān)的目的基因，并發(fā)揮了一定的作用。目前研究熱門的候選基因主要有以下幾種。

2.1 細胞外基質(zhì)蛋白 (ASPN)基因

ASPN基因因與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)而成為LDD的候選基因。Song等［7］應用微點陣和原位雜交技術(shù)對中國和日本LDD隊列進行了研究，發(fā)現(xiàn)ASPN基因的表達隨年齡增長和腰椎間盤的退變而升高，其中D14基因型占多數(shù)，且與LDD具有高度相關(guān)性。薈萃分析結(jié)果顯示，在兩個隊列中，個人攜帶至少一個D14等位基因發(fā)生LDD風險的比值比分別為1.66和1.79，表明東亞人群ASPN基因與LDD密切相關(guān)。

2.2 軟骨中間層蛋白 (CILP)基因

CILP是關(guān)節(jié)軟骨的重要結(jié)構(gòu)，與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)。Wang等［8］利用兔子腰椎退變動物模型對CILP基因在腰椎間盤組織中的表達和表達調(diào)節(jié)機制進行研究表明，正常情況下CILP基因在兔子腰椎間盤組織中高表達，其表達水平隨兔齡增長及腰椎間盤的退變程度加重而持續(xù)上調(diào);骨形態(tài)發(fā)生蛋白 －2(BMP－2)通過激發(fā)CILP基因啟動子的活性誘導CILP的表達，并且兔齡越大誘導作用越強。用基因干擾技術(shù)對表達Smad1蛋白的基因進行敲除，則BMP－2對CILP的誘導作用消失。據(jù)此推測，LDD程度、年齡和BMP－2均能對 CILP基因的表達進行調(diào)節(jié)，而BMP－2對CILP表達的調(diào)節(jié)作用則通過激活Smad1信號通路來實現(xiàn)，探討基因表達的調(diào)節(jié)機制也是研究LDD基因治療的重要方向。

2.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)基因

BMP是一種多功能生長因子，是具有成骨誘導作用的特殊蛋白質(zhì)，可以刺激間充質(zhì)干細胞分化為多種細胞。BMP家族成員眾多，目前研究較多的是BMP－2基因。Leckie等［9］采取穿刺造模并體內(nèi)注射的方法，以2型腺病毒相關(guān)病毒為載體并裝載BMP－2基因，對兔腰椎間盤細胞進行轉(zhuǎn)染，并將其作為治療組，另設空白對照組;通過MRI檢查和組織學檢查證明兩組兔子均因穿刺而造成LDD，在12周時，治療組腰椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原含量迅速增加，組織學形態(tài)也得到恢復，而對照組卻無此現(xiàn)象。提示BMP－2基因治療或許可作為LDD的一種治療手段。

2.4 生長分化因子－5(GDF－5)基因

既往研究認為GDF－5基因與骨骼的生長發(fā)育有關(guān)，但近年研究發(fā)現(xiàn)其與骨骼高度及膝骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)［10］，因而成為了LDD的候選基因。Williams等［11］對北歐人群進行的大樣本量薈萃分析結(jié)果證實，含GDF－5 T等位基因的北歐女性更容易發(fā)生腰椎間隙變窄和骨贅，與LDD密切相關(guān)。Liang等［12］利用腺病毒作為載體，將分別搭載了 GDF－5基因 (治療組)和熒光素酶基因 (對照組)的腺病毒注射到LDD小鼠腰椎間盤，2周后，治療組小鼠的椎間高度持續(xù)增加，組織學檢查結(jié)果顯示治療組小鼠腰椎間盤的組織學結(jié)構(gòu)明顯改善，而對照組無明顯改善。提示GDF－5基因可能是恢復退變腰椎間盤功能的候選基因。

3 載體

通常情況下，外源性基因很難被靶細胞所接受，這就需要載體把治療性基因轉(zhuǎn)導入靶細胞內(nèi)，載體一般分兩種，即病毒性載體和非病毒性載體。

3.1 病毒性載體 病毒是非常高效的載體，因此，在進行基因治療研究時通常選用病毒作為載體，如慢病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒 (AAV)等。雖然研究表明此類載體基本上是安全的，但人們還是對其表示擔憂。

3.1.1 慢病毒載體 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV－1)為基礎的基因治療載體，目前研究較多［13］。HIV－1型慢病毒載體具有容納較大外源性基因片段、可瞬時表達、相關(guān)指標便于檢測、表達穩(wěn)定、轉(zhuǎn)基因細胞株方便通過抗生素篩選等優(yōu)點，且引起宿主的免疫反應小，安全性較好。胡明等［14］利用慢病毒為載體將干擾片段 (siRNA)轉(zhuǎn)染人胚腰椎間盤髓核細胞，并使髓核細胞的上皮膜蛋白－1基因表達沉默，成功構(gòu)建了人胚腰椎間盤髓核上皮膜蛋白－1基因低表達細胞模型。

3.1.2 腺病毒載體 腺病毒載體是目前在轉(zhuǎn)基因研究領域應用較廣的病毒載體之一。Liang等［12］通過體內(nèi)針刺注射的辦法將分別搭載了熒光素酶基因和GDF－5基因的腺病毒載體注射到小鼠腰椎間盤，然后分別在1、2、4、8周后處死小鼠并進行腰椎間盤組織學和生化檢測;結(jié)果顯示，腺病毒存活且能高效地向腰椎間盤細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導目的基因，轉(zhuǎn)基因表達持續(xù)6周以上。表明腺病毒可能是LDD基因治療的合適載體。

3.1.3 AAV載體 研究認為，AAV載體較腺病毒載體具有更少的免疫原性，目前為止仍未發(fā)現(xiàn)其與人類或哺乳動物的任何疾病有關(guān)，且AAV載體的大小可根據(jù)搭載基因的性狀進行調(diào)節(jié)。Lattermann等［15］將攜帶不同標記基因的AAV載體注射到24只兔子腰椎間盤組織，并對轉(zhuǎn)基因的表達及機體對AAV載體的細胞體液免疫進行評估，結(jié)果顯示，AAV載體能高效地轉(zhuǎn)導腰椎間盤細胞并產(chǎn)生了很好的轉(zhuǎn)基因表達作用，即使是在一個低水平的體液免疫環(huán)境下，總轉(zhuǎn)基因效率約相當于腺病毒載體的50%。出于人們對腺病毒載體安全問題的擔憂，AAV載體可能是更好的病毒性載體。

3.2 非病毒性載體 非病毒性載體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)較病毒性載體更為安全、簡單［16］，但非病毒性載體的轉(zhuǎn)染率較病毒性載體低，而超聲微泡技術(shù)及脂質(zhì)體技術(shù)等的出現(xiàn)極大地提高了非病毒性載體的轉(zhuǎn)染率。

3.2.1 超聲微泡技術(shù) 超聲微泡技術(shù)是近年應用于基因治療的非病毒性載體技術(shù)之一，其利用超聲微泡造影劑攜帶藥物或外源性基因進入靶點，再在超聲環(huán)境下使其破裂并釋放藥物或基因。Nishida等［17］將分別加載了綠色熒光蛋白 (GFP)和熒光素酶的質(zhì)粒與超聲微泡造影劑混合，注入SD大鼠腰椎間盤后將超聲施加于注射部位 (超聲組)，同時設置空白對照組，于1、3、6、12、24周后處死大鼠，將切下的髓核組織用于轉(zhuǎn)基因評估，以正常腰椎間盤組織作對照;結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染7 d后就能在GFP轉(zhuǎn)染的髓核觀察到相當數(shù)量的GFP陽性細胞，超聲組熒光素酶活性約是空白對照組的11倍，且該方法介導的轉(zhuǎn)基因表達至少持續(xù)24周。Nishida等［17］進行的研究也是第一次以非病毒性載體在體內(nèi)進行轉(zhuǎn)染腰椎間盤細胞的報道，說明超聲微泡技術(shù)在LDD基因治療中具有很大的潛在作用。

3.2.2 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是近年應用較多的非病毒性載體，其主要成分是磷脂，與細胞膜中的天然脂質(zhì)膜具有非常相似的生物學特性［18］。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性、生物降解性，且無免疫原性，是一種對受體細胞無明顯毒性的人工組裝囊泡。脂質(zhì)體制劑對人體的安全性已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局的認同。Morrey等［19］對多種脂質(zhì)體相關(guān)載體進行了篩選，通過對它們在體外對腰椎間盤的細胞毒性、轉(zhuǎn)染率以及適宜轉(zhuǎn)染條件進行觀察發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體與蛋白質(zhì)和多胺復合體(TransIT－LT1)可能是LDD基因治療比較好的非病毒性載體。

4 RNA干擾 (RNAi)技術(shù)

腰椎間盤是體內(nèi)最大的無血管組織，其髓核被密封在兩端為終板軟骨、四周為致密纖維環(huán)的“密閉”空間。腰椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)和氧的供給主要通過終板軟骨被動擴散，這導致了髓核組織營養(yǎng)物質(zhì)和氧的匱乏，尤其是腰椎間盤中心［20］，氧分壓低而乳酸含量高。因此，耗能少和需要營養(yǎng)物質(zhì)少的治療方法也許更適合LDD的治療。近年來出現(xiàn)的針對特定基因并使其表達沉默的RNAi技術(shù)能使處于退化狀態(tài)的腰椎間盤相關(guān)基因表達下調(diào)，從而阻止腰椎間盤的退行性變。RNAi技術(shù)更注重預防腰椎間盤的退變，理論上講，還可以逆轉(zhuǎn)腰椎間盤的退變進程［6］。RNAi技術(shù)作為一種重要的防治手段已被廣泛應用于抑制特異基因的表達及其功能的研究［21］。Kakutani等［22］第一次用人類和大鼠髓核細胞做離體試驗，成功地沉默了SD大鼠和脊柱側(cè)凸個體髓核細胞中的靶基因。Seki等［23］通過體外轉(zhuǎn)染及體內(nèi)注射，利用對解整合素－金屬蛋白酶－5(ADAMTS－5)特異的siRNA轉(zhuǎn)染兔髓核細胞，結(jié)果顯示兩種方式都有效地沉默了兔髓核細胞 ADAMTS－5基因。張濤等［24］采用RNAi技術(shù)成功地沉默了大鼠腰椎間盤髓核細胞的P53及P21基因，很大程度上改善并延緩了大鼠腰椎間盤組織的退變進程。RNAi技術(shù)作為一種新型的防治LDD的基因治療手段，可以有效地抑制髓核細胞特定基因的表達，還可用以探索特定基因的作用及基因間的相互關(guān)系。

5 小結(jié)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因治療LDD將會是未來的方向，且當前研究也取得了令人矚目的成就，但大多研究仍停留于動物實驗，真正應用于臨床還有許多困難要克服:(1)腰椎間盤是人體內(nèi)最大的無血管組織，營養(yǎng)物質(zhì)及氧供應非常有限，尤其是腰椎間盤中心［20］，造成腰椎間盤再生困難。從理論上說，腰椎間盤只能支持少量能耗高的代謝活躍細胞，而促進其再生和刺激細胞外基質(zhì)合成的方法則不容易成功。(2)LDD的發(fā)病機制和腰腿痛機制仍未完全闡明，有待進一步深入研究，進而選擇最佳目的基因。 (3)基因治療的安全性及遠期效果也有待于進一步深入研究。期望未來幾年基因治療相關(guān)的研究會出現(xiàn)新突破，從而為LDD的基因治療提供更加安全可靠的方法。

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