骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中透明質(zhì)酸的表達(dá)水平

朱藍(lán)玉 秦彥國 黃衛(wèi)東 李 光 (長春中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)教研室，吉林 長春 307)

骨性關(guān)節(jié)炎是一種由多種原因所致的慢性退行性關(guān)節(jié)病變，以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要特征〔1～3〕。目前保守治療認(rèn)為有效的辦法是關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸(HA)，因此，尋找HA在骨性關(guān)節(jié)炎患者中的含量變化將為臨床治療提供最有利的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料 長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供4月齡健康實驗大鼠40只，體重210 g左右。HA酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒，吉林大維生物科技實業(yè)有限公司產(chǎn)品。主要儀器:酶標(biāo)儀(Thermo Electron，USA)、光電顯微鏡(蘇州光電科技有限公司)、半自動石蠟切片機(jī)(吉林醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、Olympus倒置顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司生產(chǎn))。

1.2 模型制備與分組 隨機(jī)分為兩組:對照組20只不做任何處理。20只為模型組，首先在麻醉下切開膝關(guān)節(jié)皮膚、皮下組織、筋膜后切開關(guān)節(jié)囊，在直視下切斷前交叉韌帶，摘除半月板，待10 d切口愈合后每天早晚用4℃冷水冷凍刺激大鼠手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)處各2 h。

1.3 標(biāo)本采集及處理 分別于造模完成后3、6 w用100 g/L的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉動物，而后用氣栓法處死模型組和對照組各10只大鼠，逐層切開膝關(guān)節(jié)，抽取膝關(guān)節(jié)液，ELISA法檢測血清中HA含量。而后觀察標(biāo)本滑膜、軟骨大體形態(tài)，切取關(guān)節(jié)滑膜和脛骨內(nèi)側(cè)髁軟骨，10%中性甲醛溶液固定后，石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.10統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析及q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)大體肉眼觀察 對照組大鼠膝關(guān)節(jié)無腫脹、充血，關(guān)節(jié)液透明，滑膜無水腫、肥厚，關(guān)節(jié)軟骨呈淡藍(lán)色、半透明、光滑;模型組大鼠膝關(guān)節(jié)在3 w時腫脹、充血明顯，關(guān)節(jié)液呈淡黃色渾濁狀態(tài)，關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;6 w滑膜明顯增厚，與股骨粘連嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面軟骨色澤灰暗、軟骨缺損明顯、潰瘍形成。

2.2 病理改變 正常對照組HE染色示軟骨切線層、移形層、深層和鈣化層層次清楚，細(xì)胞排列整齊。骨性笑節(jié)炎模型組在3 w時顯示切線層大部分缺失，移形層嚴(yán)重受損，細(xì)胞肥大，大量簇集，大量毛細(xì)血管侵入軟骨下骨及鈣化層;6 w時顯示，縱向結(jié)構(gòu)受到破壞，連續(xù)性較差，出現(xiàn)較多的斷裂點。

2.3 兩組關(guān)節(jié)液中HA含量比較 模型組3 w、6 w與對照組3 w、6 w相比HA含量有顯著差異〔(21.46±0.59)、(11.32±0.79)ng/ml vs(17.28 ± 0.43)、(17.53 ± 0.29)ng/ml，P＜0.01〕。

3 討論

老年骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與多種因素相關(guān)，受患者的年齡、肢體的力線、病史等多種可致病因素影響，常常伴有炎癥的癥狀和體征，包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和強直等，可以導(dǎo)致不同程度的功能受限〔4〕。目前保守治療的辦法多種多樣，主要包括減輕負(fù)重、支具保護(hù)、非甾體類抗炎藥的應(yīng)用〔5〕，尤其HA的關(guān)節(jié)腔注射目前認(rèn)為是比較有效的方案。

HA是一類關(guān)節(jié)滑膜所分泌的非硫酸性糖胺聚糖，是滑液具有黏性的最重要因素，其通過分子屏障保護(hù)作用限制關(guān)節(jié)腔內(nèi)各種炎性介質(zhì)以及組織降解、代謝產(chǎn)物等在關(guān)節(jié)腔里的擴(kuò)散。而且具有潤滑、營養(yǎng)以及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的重要作用。HA的黏彈性能夠穩(wěn)定并升高痛覺感受器的閾值;同時，HA能夠阻止炎性遞質(zhì)的釋放，以減少化學(xué)物質(zhì)的疼痛刺激〔6〕。HA通過和糖蛋白結(jié)合形成結(jié)合體以維護(hù)正常軟骨組織的完整性，對關(guān)節(jié)軟骨起到營養(yǎng)保護(hù)作用〔7〕，降低軟骨和滑膜之間的摩擦力，有效地阻止炎性介質(zhì)的侵入，并防止軟骨基質(zhì)的破壞。

在本研究中，3 w時關(guān)節(jié)液內(nèi)的HA增高。考慮為關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織在受到外來刺激時，自我的保護(hù)反應(yīng)刺激了HA的分泌，這恰恰證明HA對于關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。但隨著時間的推移，6 w時關(guān)節(jié)內(nèi)炎性反應(yīng)更加嚴(yán)重，HA的分泌呈顯著下降的狀態(tài)，這恰恰與發(fā)生在人體的病理變化過程相似。當(dāng)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行到嚴(yán)重的程度，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)液分泌減少，而此時關(guān)節(jié)腔內(nèi)HA的注射往往可以收到非常明顯的療效。本研究通過動物模型的建立驗證了HA臨床治療的客觀依據(jù)，但尚存在動物模型與人體之間的差異及長時間的實驗觀察。

1 Goldring MB，Goldring SR.Osteoarthritis〔J〕.J Cell Physiol，2007;213(3):626-34.

2 唐福林.應(yīng)重視骨與關(guān)節(jié)病的研究〔J〕.中華全科醫(yī)師雜志，2003;2(6):337-8.

3 張 洪，江捍平，王大平.關(guān)節(jié)制動制作骨性關(guān)節(jié)炎動物模型的探討〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006;16(12):1843-4.

4 劉延青，婁思權(quán).骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的實驗研究〔J〕.骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2000;15(2):123-5.

5 玄 勇，魯艷莉，李 晶，等.膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的運動療法〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2003;18(9):523-5.

6 Yoo HS，Lee EA，Yoon JJ，et al.Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering〔J〕.Biomaterials，2005;26(14):1925-33.

7 Karna E，Miltyk W，Palka JA，et al.Hyaluronic acid counteracts interleukin-1-induced inhibition of collagen biosynthesis in cultured human chondrocytes〔J〕.Pharmacol Res，2006;54(4):275-81.