甲殼素、殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響研究進(jìn)展

浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 王 月 楊彬彬 邵慶均

在集約化程度不斷提高的現(xiàn)代養(yǎng)殖模式下，營(yíng)養(yǎng)缺陷、環(huán)境因素等易誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生疾病，并且一旦發(fā)病嚴(yán)重，極易以水生環(huán)境為媒介發(fā)生大規(guī)模的傳播和感染，引起水產(chǎn)動(dòng)物大量死亡。因此，水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)防工作成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中極為重要的環(huán)節(jié)。從營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的角度增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力成為防控水產(chǎn)動(dòng)物疾病的研究熱點(diǎn)。甲殼素和殼聚糖作為飼料添加劑，在調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能、提高抗病能力等方面效果明顯。

1 甲殼素和殼聚糖的理化性質(zhì)

甲殼素，又稱幾丁質(zhì)，是一種天然黏多糖，廣泛存在于甲殼動(dòng)物、昆蟲的外殼及真菌、藻類的細(xì)胞壁中，自然界中其產(chǎn)量?jī)H次于纖維素。天然甲殼素是聚2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖以1，4糖苷鍵連接而成的無分支的線形高分子聚合物。甲殼素是除蛋白質(zhì)外數(shù)量最大的含氮天然有機(jī)化合物。甲殼素可以被溶菌酶、幾丁質(zhì)酶降解，具有較低的免疫原性，而生物相容性和生物降解性較好。甲殼素與纖維素結(jié)構(gòu)十分相似，不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定（Ravi Kumar，2000）。

通常情況下，甲殼素在堿性條件下進(jìn)行乙?；幚淼漠a(chǎn)物是殼聚糖。自然界中的多聚糖一般為酸性或中性，而殼聚糖是自然界中少有的堿性高聚物。因此，較易形成多氧鹽、螯合金屬離子等。程珊珊等（2011）研究報(bào)道，殼聚糖對(duì)水體中鎘離子（Cd2+）和鉛離子（Pb2+）具有較強(qiáng)的吸附作用。

2 甲殼素及殼聚糖的免疫促進(jìn)作用

有研究認(rèn)為，甲殼素及殼聚糖可以刺激機(jī)體的非特異性免疫，提高機(jī)體抵抗細(xì)菌及病毒的能力，并且具有抗腫瘤細(xì)胞的活性 （Nishimura等，1984）。

甲殼素和殼聚糖可以活化巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞來表達(dá)一些引起發(fā)炎反應(yīng)的細(xì)胞因子，如白介素-1、集落刺激因子和γ干擾素等（Lee等，2008）。并且有研究還發(fā)現(xiàn)，甲殼素和殼聚糖的混合程度對(duì)其發(fā)揮免疫促進(jìn)劑的作用有關(guān)，由30%甲殼素和70%殼聚糖混合后產(chǎn)生的活化巨噬細(xì)胞的作用比單純的甲殼素或殼聚糖的作用效果更佳（Iida等，1987）。有的研究則報(bào)道，在抵抗念珠菌感染上，甲殼素促進(jìn)免疫的作用與給予的劑量有關(guān)。

近年來也有試驗(yàn)表明，天然甲殼素因分子質(zhì)量巨大、聚合度高而未表現(xiàn)出顯著提高機(jī)體免疫指標(biāo)的作用，相比之下，經(jīng)過處理后分子量較小的殼聚糖或甲殼素片段則在增強(qiáng)免疫方面有著較強(qiáng)的作用。Shibata等（1997）首先在小鼠上用細(xì)小的甲殼素顆粒（1～10 μm）進(jìn)行靜脈注射，發(fā)現(xiàn)小片段的甲殼素可以活化肺泡巨噬細(xì)胞以表達(dá)如白介素-12、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白介素-18，并刺激自然殺傷細(xì)胞分泌干擾素INF-γ。并且進(jìn)一步證明了這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生是基于一種依賴甘露糖受體的細(xì)胞吞噬作用途徑。甲殼素顆粒在甘露糖受體的協(xié)助作用下完成吞噬細(xì)胞的內(nèi)化作用，再由巨噬細(xì)胞溶菌酶和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶降解。

Reese等（2007）在研究甲殼素體內(nèi)促免疫作用時(shí)，將甲殼素和殼聚糖顆粒由表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的白介素-4的小鼠鼻腔直接注入肺部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾小時(shí)后一些分泌白介素-4的免疫細(xì)胞，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞在肺部被大量募集。表明甲殼素可以活化一些非特異性免疫細(xì)胞，引起過敏類的發(fā)炎反應(yīng)。

3 甲殼素及殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響

目前，針對(duì)甲殼素及殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響上研究報(bào)道較多，絕大多數(shù)是關(guān)于甲殼素及殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的影響，而很少涉及其對(duì)特異性免疫系統(tǒng)的作用。這可能與目前對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物特異性免疫系統(tǒng)的研究并不十分深入有關(guān)。近年來，隨著虹鱒甲殼素結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)，關(guān)于甲殼素對(duì)魚體免疫作用的研究進(jìn)一步深入（Rusell等，2008）。甲殼素結(jié)合蛋白存在于虹鱒的鰓、脾臟、肝竇、腎間質(zhì)腸、皮膚、魚鰾以及白細(xì)胞內(nèi)部。這種蛋白質(zhì)與人和嚙齒類的一種血漿凝集素屬于同源蛋白。Schlosser等（2009）在小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了一種甲殼素受體蛋白，這種甲殼素受體蛋白是一種由FIBCD1基因表達(dá)的同源四聚體跨膜蛋白，在包括魚類的脊椎動(dòng)物中結(jié)構(gòu)比較保守，并在消化道中高度表達(dá)。這種受體通過一種與乙?；募讱に鼗蚣讱に仄胃哂H和性的鈣依賴性途徑參與到細(xì)胞內(nèi)吞作用中。

3.1 海水魚類 Esteban等（2000）用直徑小于10 μm的甲殼素顆粒對(duì)金頭鯛（Sparus aurata L.）進(jìn)行靜脈注射和腹腔注射，發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射的金頭鯛其體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)均顯著提高。天然補(bǔ)體溶血活性在注射5 d后提高，但沒有達(dá)到顯著水平；呼吸爆發(fā)和吞噬細(xì)胞吞噬能力分別在3 d和5 d后達(dá)到峰值；細(xì)胞毒素活性在3 d后顯著提高并一直持續(xù)至注射后10 d。而靜脈注射對(duì)金頭鯛的各項(xiàng)免疫指標(biāo)均未產(chǎn)生顯著影響。Esteban（2001）用甲殼素添加水平分別為25、50 mg/kg和100 mg/kg的飼料飼喂初重為（125±13）g的金頭鯛，分別在第2、4、6周測(cè)定其各項(xiàng)非特異性免疫指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂水平為25 mg/kg和50 mg/kg的金頭鯛非特異性免疫得到顯著提高；天然補(bǔ)體溶血活性和細(xì)胞毒素活性在飼喂2周后顯著提高，呼吸爆發(fā)和吞噬細(xì)胞吞噬能力分別在飼喂甲殼素4周和6周后顯著提高；而溶菌酶活性和生長(zhǎng)性能則沒有受到顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，適量的甲殼素可以提高魚體免疫功能，而添加量過高則可能不會(huì)起到提高免疫功能的作用。并且甲殼素對(duì)不同免疫指標(biāo)的影響具有時(shí)間差異。Cuesta和Esteban（2003）研究進(jìn)一步證明，甲殼素顆粒的大小對(duì)免疫細(xì)胞的吞噬能力也有影響。用含有不同大小的甲殼素顆粒的培養(yǎng)液培養(yǎng)金頭鯛的白細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞只能吞噬直徑小于10 μm的甲殼素顆粒，并在培養(yǎng)1～4 h后白細(xì)胞的吞噬能力得到提高，但其呼吸爆發(fā)未受到顯著影響。金頭鯛白細(xì)胞吞噬甲殼素顆粒很可能是通過甘露糖/巖藻糖受體途徑，這種受體主要識(shí)別含氨基或亞氨基的抗原并激發(fā)白細(xì)胞的一系列免疫反應(yīng)，目前僅在哺乳動(dòng)物和金頭鯛中發(fā)現(xiàn)，而在其他魚類中尚未見報(bào)道（Cuesta 和 Esteban，2003）。

3.2 淡水魚類 Choudhury等 （2005）給初重為（13.40±0.17） g 的露斯塔野鯪（Labeo rohita L.）飼喂甲殼素添加水平為25 mg/kg和50 mg/kg的飼料，15 d后發(fā)現(xiàn)，對(duì)露斯塔野鯪的增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率等均無顯著影響，也未顯著提高試驗(yàn)魚的白細(xì)胞數(shù)量、呼吸爆發(fā)等免疫指標(biāo)。用嗜水氣單孢菌（Aeromonas hydrophila）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后，飼喂甲殼素的試驗(yàn)魚存活率未得到顯著提高。這可能與甲殼素添加水平過低不足以起到免疫增強(qiáng)劑的作用有關(guān)。Gopalakannan和 Arul（2006）試驗(yàn)證明，鯉魚（Cyprinus carpio）在飼喂1%甲殼素或殼聚糖后，其溶菌酶活性和利用NBT法測(cè)得鯉魚嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)在飼喂30 d后達(dá)到峰值，并且飼喂殼聚糖組的溶菌酶活性約是飼喂甲殼素組的2倍，峰值過后雖一定程度下降但仍顯著高于對(duì)照（P＜0.001）。45 d和90 d后用分別用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)45 d后飼喂甲殼素和殼聚糖組的相對(duì)成活率分別是40%和80%，而90 d后分別降低到37.5%和68.9%。相對(duì)成活率是反映免疫促進(jìn)劑或疫苗有效性的指標(biāo)，一般大于50%即可視為有效提高免疫。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的殼聚糖可以提高鯉魚的非特異性免疫功能，并且作用效果優(yōu)于甲殼素。華雪銘等（2007）研究了飼料中添加殼聚糖對(duì)暗紋東方鲀（Fugu obscurus）抗病力和免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用添加了0.2%、0.5%、1.0%的殼聚糖的基礎(chǔ)飼料投喂平均體重為（3.15±0.05）g暗紋東方鲀 2個(gè)月后，脾臟自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性顯著提高；試驗(yàn)魚的頭腎B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)分泌的IgM顯著增加。陳勇等（2010）以含0.50%殼聚糖A（分子量較?。┖?.50%殼聚糖B（分子量較大）的基礎(chǔ)飼料分別投喂2齡異育銀鯽 （Carassius auratus gibelio），64 d后發(fā)現(xiàn)，兩種殼聚糖均可顯著提高異育銀鯽外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞吞噬活性和脾臟溶菌酶活性（P＜0.05），顯著降低外周血多形核細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），并且殼聚糖A能夠顯著提高異育銀鯽脾臟B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力；同時(shí)顯著提高異育銀鯽血清中T3的含量 （P＜0.05），顯著降低異育銀鯽血清中皮質(zhì)醇和T4淋巴細(xì)胞的含量（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖通過提高血清T3水平、降低血清皮質(zhì)醇水平增強(qiáng)異育銀鯽的非特異免疫功能。并且，試驗(yàn)也驗(yàn)證了殼聚糖分子量的大小可能影響其對(duì)魚類細(xì)胞免疫的作用，分子量較小的殼聚糖具有更好的增強(qiáng)免疫的效果。翟少偉和劉淑蘭（2011）與賈景濤等（2012）分別試驗(yàn)研究了水體中添加殼聚糖后對(duì)水環(huán)境鎘或鋅致羅非魚（Oreochromis Niloticus）急性中毒的影響。結(jié)果表明，養(yǎng)殖水體中加入一定濃度的殼聚糖對(duì)鎘或鋅致羅非魚急性毒性有顯著改善作用，試驗(yàn)組魚的病死率顯著低于對(duì)照組。這可能與殼聚糖可以螯合水體中重金屬離子的功能有關(guān)。

3.3 甲殼類 Powell和 Rowley（2007）在普通濱蟹（Carcinus maenas）的餌料中添加了 5%和10%的甲殼素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組蟹成活率顯著提高，但非特異性免疫指標(biāo)并無顯著改善，而肝胰臟和血淋巴中細(xì)菌總數(shù)顯著低于對(duì)照組。這可能與甲殼素的添加改善了試驗(yàn)蟹的消化道微生物群系有關(guān)。Wang 和 Chen（2005）用 4、6、8 μg/g 的甲殼素和 2、4、6 μg/g 殼聚糖分別注射均重 （10.4±0.7） g凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的頭胸部腹側(cè)竇后，用溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，6 d后發(fā)現(xiàn)，注射過甲殼素或殼聚糖組的試驗(yàn)蝦成活率顯著高于對(duì)照組，并發(fā)現(xiàn)注射6 μg/g甲殼素和4、6 μg/g殼聚糖的試驗(yàn)蝦其血細(xì)胞總數(shù)和呼吸爆發(fā)在2 d后顯著提高，酚氧化酶活性在注射6 d后一直保持較高水平。Zhu等（2010）用添加水平分別為5、10 mg/g和15 mg/g甲殼素或殼聚糖的飼料飼喂初重為20 g左右的克氏原螯蝦（Procambarus clarkia），4周后用感染了白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的克氏原螯蝦尾部肌肉飼喂試驗(yàn)蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/g殼聚糖飼喂組累積死亡率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組克氏原螯蝦的血細(xì)胞總數(shù)、原酚氧化酶活性和雙氧化物歧化酶活性（SOD）等免疫指標(biāo)均顯著提高。并且飼喂殼聚糖的試驗(yàn)組蝦各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于飼喂甲殼素的試驗(yàn)組。

另外，也有研究證明，甲殼素或殼聚糖對(duì)某些水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能無顯著的改善作用。Lin等（2011）用添加了0.2%殼聚糖的飼料飼喂錦鯉（Cyprinus carpio koi），56 d 后發(fā)現(xiàn)，無論是白細(xì)胞總數(shù)，還是非特異性免疫的體液免疫、細(xì)胞免疫指標(biāo)均未發(fā)生顯著變化。

4 小結(jié)

綜上所述，大量試驗(yàn)研究表明，適量添加甲殼素或殼聚糖可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫功能、提高水產(chǎn)動(dòng)物抵抗和防御病原微生物感染的能力。但是，目前為止對(duì)甲殼素和殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的作用機(jī)理研究并不深入，因此可以借鑒其在小鼠等哺乳動(dòng)物中的研究成果，為甲殼素和殼聚糖在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究提供引導(dǎo)和方向。

今后應(yīng)針對(duì)以下問題進(jìn)行深入研究：（1）進(jìn)一步明確甲殼素和殼聚糖的作用機(jī)制和影響因素。（2）深入了解添加方式、給予途徑、添加水平和顆粒大小對(duì)甲殼素和殼聚糖作用的影響，針對(duì)不同水產(chǎn)品種摸索最佳添加水平。（3）開展甲殼素、殼聚糖與其他免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑的協(xié)同作用研究。（4）在國(guó)內(nèi)更多名貴養(yǎng)殖品種上展開研究。（5）探討甲殼素的其他衍生物，如稀土甲殼素、殼聚寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響作用。

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